Summary

Purification de la chromatine du locus génique en copie unique chez Saccharomyces cerevisiae

Published: November 17, 2023
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Summary

Ce protocole présente une méthode d’isolement de la chromatine spécifique au locus basée sur la recombinaison spécifique au site pour purifier un locus de gène d’intérêt en une seule copie dans son contexte chromatin natif à partir d’une levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

L’unité organisationnelle de base de la chromatine eucaryote est la particule centrale du nucléosome (NCP), qui comprend l’ADN enroulé ~ 1,7 fois autour d’un octamère d’histone. La chromatine est définie comme l’entité des NCP et de nombreux autres complexes protéiques, y compris les facteurs de transcription, le remodelage de la chromatine et les enzymes modificatrices. On ne sait toujours pas comment ces interactions protéine-ADN sont orchestrées au niveau de loci génomiques spécifiques au cours des différentes étapes du cycle cellulaire. Cela est principalement dû aux limitations techniques actuelles, qui rendent difficile l’obtention de mesures précises de telles interactions dynamiques. Nous décrivons ici une méthode améliorée combinant une recombinaison spécifique au site avec un protocole efficace de purification par affinité en une seule étape pour isoler un locus de gène d’intérêt en une seule copie dans son état natif de chromatine. La méthode permet l’enrichissement robuste du locus cible sur la chromatine génomique, ce qui fait de cette technique une stratégie efficace pour identifier et quantifier les interactions protéiques de manière non biaisée et systématique, par exemple par spectrométrie de masse. À la suite de ces analyses de composition, la chromatine native purifiée par cette méthode reflète probablement la situation in vivo concernant le positionnement des nucléosomes et les modifications des histones et se prête donc à d’autres analyses structurales et biochimiques de la chromatine dérivée de pratiquement n’importe quel locus génomique chez la levure.

Introduction

L’organisation dynamique des génomes eucaryotes en chromatine compacte l’ADN pour qu’il s’adapte aux limites du noyau tout en assurant une dynamique suffisante pour l’expression des gènes et l’accessibilité pour les facteurs régulateurs. En partie, cette polyvalence est médiée par le nucléosome, l’unité de base de la chromatine, qui comprend une particule centrale avec 147 pb d’ADN enroulé ~ 1,7 fois autour de l’octamère de l’histone1. Le nucléosome est une structure très dynamique en ce qui concerne sa composition, avec de nombreuses variantes d’histones et des modifications post-traductionnelles (PTM) sur les queues d’histones N- et C-terminales. De plus, la chromatine eucaryote interagit avec une multitude d’autres composants essentiels, tels que les facteurs de transcription, les mécanismes de traitement de l’ADN et de l’ARN, les protéines architecturales, les enzymes impliquées dans le remodelage et la modification de la chromatine et les molécules d’ARN associées à la chromatine. Ces mécanismes cruciaux impliqués dans la transcription, la réplication et la réparation nécessitent tous un accès à la chromatine, qui sert de substrat naturel à ces processus. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces transactions d’ADN nécessite une définition précise des altérations collectives de la structure de la chromatine dans les régions génomiques spécifiques où ces mécanismes convergent et facilitent les réactions biologiques.

Malgré l’identification de nombreux facteurs de la chromatine par le biais d’études génétiques et d’études d’interaction protéine-protéine, la réalisation d’analyses directes, impartiales et complètes des interactions de la chromatine sur des sites génomiques particuliers est restée un obstacle important 2,3. Dans un premier temps, seules des régions très abondantes du génome (c’est-à-dire des loci répétitifs) ou des plasmides multi-copies ont pu être isolés en quantités et en pureté suffisantes pour permettre l’identification par spectrométrie de masse des protéines associées 4,5,6,7. Une série de nouvelles approches basées sur l’hybridation directe de sondes de capture à l’ADN chromatinisé, la biotinylation de proximité à l’aide du système CRISPR-dCas9 ou la liaison de protéines adaptatrices spécifiques à la séquence au locus d’intérêt ont commencé à démêler le protéome des loci à copie unique à partir de génomes de levures et de mammifères 8,9,10. Cependant, toutes ces méthodes nécessitent la réticulation du formaldéhyde pour stabiliser les interactions protéine-ADN et la sonication pour solubiliser la chromatine en vue d’une purification ultérieure. Ensemble, les deux manipulations excluent la possibilité d’études structurelles et fonctionnelles ultérieures de la chromatine purifiée.

Pour surmonter ces limitations, nous avons précédemment conçu une méthodologie qui utilise la recombinaison spécifique au site pour extraire les domaines chromosomiques ciblés de la levure11,12. Essentiellement, la région génomique d’intérêt est entourée de sites de reconnaissance (RS) pour la R-recombinase spécifique du site de Zygosaccharomyces rouxi tout en incorporant simultanément un groupe de trois sites de liaison à l’ADN pour la protéine répressive transcriptionnelle procaryote LexA (LexA) dans la même région. Les cellules de levure contiennent une cassette d’expression pour l’expression simultanée de la R-recombinase et une protéine LexA fusionnée à un marqueur de purification par affinité en tandem (TAP). Après l’induction de la R-recombinase, l’enzyme excise efficacement la région ciblée du chromosome sous la forme d’un domaine de chromatine circulaire. Ce domaine peut être purifié via la protéine adaptatrice LexA-TAP, qui se lie aux sites de liaison à l’ADN LexA, ainsi qu’à un support d’affinité. Cette méthode a été récemment utilisée pour isoler des domaines distincts de la chromatine contenant des origines de réplication sélectionnées du chromosome III13 de la levure.

L’un des avantages majeurs de cette approche ex vivo est qu’elle permet des analyses fonctionnelles du matériau isolé. Par exemple, les domaines d’origine de réplication purifiés avec cette méthode peuvent être soumis à des tests de réplication in vitro pour évaluer l’efficacité de la cuisson d’origine dans un tube à essai à partir de matrices de chromatine assemblées in vivo natives. À terme, la caractérisation biochimique et fonctionnelle du matériel isolé pourrait permettre la reconstitution des processus nucléaires à l’aide de protéines purifiées et de la matrice de chromatine native. En résumé, cette méthodologie ouvre une voie passionnante dans la recherche sur la chromatine, car il sera possible de suivre les changements collectifs de composition et de structure de la chromatine d’une région génomique spécifique subissant une certaine transaction chromosomique.

Protocol

Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole. Reportez-vous au tableau 1 pour obtenir la liste des solutions, des tampons et des supports utilisés. 1. Construction de souches de levure recombinantes Pour construire une souche de levure compétente en recombinaison, transformer le plasmide K238 digéré par SbfI en une souche de levure avec des sites de liaiso…

Representative Results

La purification du domaine chromatin ARS316 de ~1,4 kb a été médiée par la protéine adaptatrice LexA-TAP exprimée de manière constitutive. Pour servir de contrôle négatif, nous avons effectué des purifications à l’aide d’une souche isogénique qui exprime LexA-TAP mais ne contient pas de sites intégrés de liaison RS et LexA. La figure 3 illustre le résultat de l’analyse de l’ADN d’une expérience de purification standard réalisée à la fois sur la souche témoin et …

Discussion

L’identification des facteurs et du paysage chromatin d’une région génomique cible spécifique continue de poser un défi majeur dans la recherche sur la chromatine18. Ce protocole décrit un système efficace pour exciser et purifier spécifiquement les domaines distincts de la chromatine des chromosomes de levure. À notre connaissance, la pureté et le rendement de cette purification en une seule étape permettent de surmonter de nombreuses limitations des méthodes de purification de la …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les travaux du laboratoire S.H. ont été soutenus par la DFG par le biais de SFB1064 (ID de projet 213249687), le Conseil européen de la recherche (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) et la Helmholtz Gesellschaft.

Materials

Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

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