التحليل الآلي الأمثل لتعديل توازن الميتوكوندريا العصبية الحية بواسطة مستقبلات حمض الريتينويك الخاصة بالنظائر
Summary
شبكة الميتوكوندريا معقدة للغاية ، مما يجعل تحليلها صعبا للغاية. تقوم أداة MATLAB الجديدة بتحليل الميتوكوندريا الحية المصورة متحدة البؤر في صور الفاصل الزمني ولكنها تؤدي إلى حجم إخراج كبير يتطلب اهتماما يدويا فرديا. لمعالجة هذه المشكلة ، تم تطوير تحسين روتيني ، مما يسمح بتحليل سريع للملف.
Abstract
تجعل شبكة الميتوكوندريا المعقدة من الصعب للغاية تقسيم الخلايا الحية ومتابعتها وتحليلها. تسمح أدوات MATLAB بتحليل الميتوكوندريا في ملفات الفاصل الزمني ، مما يبسط ويسرع عملية معالجة الصور إلى حد كبير. ومع ذلك ، فإن الأدوات الحالية تنتج حجم إخراج كبير ، يتطلب اهتماما يدويا فرديا ، والإعدادات التجريبية الأساسية لها إخراج من آلاف الملفات ، كل منها يتطلب معالجة واسعة النطاق وتستغرق وقتا طويلا.
لمعالجة هذه المشكلات ، تم تطوير تحسين روتيني ، في كل من كود MATLAB ونماذج النص المباشر ، مما يسمح بتحليل سريع للملفات وتقليل قراءة المستندات ومعالجة البيانات بشكل كبير. بسرعة 100 ملف / دقيقة ، يسمح التحسين بإجراء تحليل سريع شامل. يحقق التحسين مخرجات النتائج عن طريق حساب متوسط البيانات الخاصة بالإطار للميتوكوندريا الفردية عبر الأطر الزمنية ، وتحليل البيانات بطريقة محددة ، بما يتفق مع تلك المخرجات من الأدوات الحالية. تم إجراء التصوير الحي متحد البؤر باستخدام صبغة رباعي ميثيل رودامين إستر الميثيل ، وتم التحقق من صحة التحسين الروتيني من خلال علاج الخلايا العصبية بمنبهات مستقبلات حمض الريتينويك (RAR) ، والتي تم تحديد آثارها على الميتوكوندريا العصبية في الأدبيات. كانت النتائج متسقة مع الأدبيات وسمحت بمزيد من التوصيف لسلوك شبكة الميتوكوندريا استجابة لتعديل RAR الخاص بالنظائر.
سمحت هذه المنهجية الجديدة بالتوصيف السريع والتحقق من صحة شبكة الميتوكوندريا العصبية الكاملة ، ولكنها تسمح أيضا بالتمايز بين الميتوكوندريا المحورية وجسم الخلية ، وهي ميزة أساسية يجب تطبيقها في مجال علم الأعصاب. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على التجارب التي تستخدم علاجات سريعة المفعول ، مما يسمح بتصوير نفس الخلايا قبل وبعد العلاج ، متجاوزا مجال علم الأعصاب.
Introduction
تقع الميتوكوندريا الخلوية في مركز جميع الحالات الفسيولوجية ، والفهم الشامل لتوازنها (الميتوستاسيس) وسلوكها أمر بالغ الأهمية للمساعدة في تحديد العلاج الدوائي لمجموعة واسعة من الأمراض ، بما في ذلك السرطان ومرض الزهايمر 1,2.
تلعب الميتوكوندريا أدوارا خلوية حاسمة في توازن الطاقة ، وتوليد ATP ، وتخزين الكالسيوم المؤقت ، وتنظيم أنواع الأكسجين التفاعلية ، والميتوكستاس ضروري للحفاظ على توازن البروتين لأن المرافقين الجزيئيين يعتمدون على الطاقة3. ويتطلب ذلك تعديلا ثابتا وديناميا للشبكة وتكيفا لتلبية الاحتياجات الخلوية بكفاءة، وينظم نقل الميتوكوندريا مسارات إشارات مختلفة؛ وقد وصف العمل السابق أحد هذه المسارات ، وهو مستقبلات حمض الريتينويك (RARs)4,5. حمض الريتينويك (RA) يعزز نمو المحور العصبي والعصبي عن طريق تنشيط RAR. في الخلايا العصبية القشرية الأولية للفأر ، يشجع تنشيط RAR-β نمو الميتوكوندريا وسرعتها وحركتها في الخلايا العصبية6.
بالنظر إلى قدرة شبكة الميتوكوندريا على التكيف وديناميكياتها ، فإن إمكانية تقييم الانقسام في “الوقت الفعلي” ضرورية ليس فقط للتحقيق في توازن الطاقة ، ولكن أيضا للبروتين أو الصحة الخلوية أو الانتشار أو الإشارات. تعتمد الطريقة الشائعة الاستخدام لتقييم الانقسام على الفحص المجهري متحد البؤر بعد تسليط الضوء على الميتوكوندريا باستخدام صبغة أو علامة فلورية ، بالإضافة إلى إعداد مجهري محدد يسمح بدرجة الحرارة و / أو تنظيم CO2 7. يستلزم هذا النوع من الإعداد التجريبي إجراء نسخة تجريبية واحدة في كل مرة. بالإضافة إلى التكرار التجريبي للمعالجات المختلفة ، يجب مراعاة أن معظم التجارب يجب أن يكون لها تكراراتها التقنية (حيث يتم تصوير أكثر من موضع واحد لكل لوحة) ، مع تسجيل سلسلة من المستويات البؤرية (z-stacks) في سلسلة من النقاط الزمنية. وبالتالي ، فإن التصميم التجريبي مع ثلاثة تكرارات لعنصر تحكم واحد ومعالجتين ، مع خمسة أوضاع تصوير لكل لوحة ، و 15 نقطة زمنية ، ينتج عنه 225 مكدسا لتتم معالجتها. كلاسيكيا ، تم تحليل مقاطع الفيديو الخاصة بالميتوكوندريا الحية عن طريق رسم أجهزة القياس الكمي ، والتي سيتم تحليلها بشكل فردي8 ، في عملية تستغرق وقتا طويلا وتتطلب إدخالا يدويا مكثفا ، حتى عند الاعتماد على أدوات الكمبيوتر.
تموصف خوارزمية 9 مؤخرا تسمح بالتجزئة الآلية وتتبع الميتوكوندريا في ملفات الفاصل الزمني 2-D و 3-D للخلايا الحية. تتوفر تقنيات القياس الكمي الأخرى ، ولكل منها حدودها10. يعد Mitometer ، وهو تطبيق آلي مفتوح المصدر ، مناسبا بشكل خاص لتحليل ديناميكيات الفاصل الزمني والميتوكوندريا ، مما يتطلب مدخلات منخفضة من المستخدم. يتمتع هذا التطبيق بسلسلة من المزايا مقارنة بالأدوات الأخرى القائمة على MATLAB ، وهي السماح بالمعالجة التلقائية لمكدسات TIF الفردية ، باستخدام ما يصل إلى 13 معلمة مختلفة ، مثيرة للاهتمام بشكل خاص لعلوم الأعصاب ، لأنها تميز بين الميتوكوندريا المحيطة بالنواة وعن بعد.
ومع ذلك ، بالنسبة لتجربة مثل الموضحة أعلاه ، فإن هذه المعلمات ال 13 المطبقة على 225 مكدسا ينتج عنها 2925 ملف إخراج فردي. تتطلب هذه أربعة مدخلات كمبيوتر فردية ، والتي يصل مجموعها إلى أكثر من 10000 إدخال يدوي مطلوب لتنزيل جميع ملفات الإخراج. بالنسبة للتصميمات التجريبية الكبيرة ، ينتج عن ذلك تحليل مستهلك للوقت للغاية لكل ملف وتكامل البيانات. نقدم هنا تحسينا روتينيا يسمح بتحليل سريع للملفات ، مما يقلل بشكل كبير من قراءة المستندات ومعالجة البيانات ، وتحليل البيانات بطريقة محددة ، بما يتفق مع المخرجات من الأدوات الحالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ينتج التصوير الخلوي الحي ملفات كبيرة تتطلب معالجة حوسبة جادة ، ولكن حتى أحدث الأدوات تتطلب إدخالا يدويا مكثفا للمعالجة. يركز هذا التحسين الروتيني على تبسيط عملية تحليل الميتوكوندريا على مقياس الانقسام لأن هذه الأداة تقدم توازنا جيدا جدا بين مدخلات المستخدم وإخراج البيانات. تمت مراجعة مق…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إجراء الحصول على الصور في منشأة LiM الخاصة ب iBiMED ، وهي عقدة PPBI (المنصة البرتغالية للتصوير الحيوي): POCI-01-0145-FEDER-022122. تم دعم هذا العمل من قبل FCT (EXPL / BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276) ، وهي منحة إلى DT من Fundação para a Ciência e Tecnologia of Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND) ، منحة من ATG-The Gabba Alumni Association إلى نائب الرئيس ، ومعهد الطب الحيوي-iBiMED ، جامعة أفيرو.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
Referenzen
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -. H., Tseng, W. -. W., Hsu, C. -. M., Wei, A. -. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
