Uma abordagem de visão mecânica para fluxos de trabalho de microscopia eletrônica de transmissão, análise de resultados e gerenciamento de dados

A interpretação dos resultados experimentais do ETM é frequentemente dependente de muitos parâmetros experimentais interconectados, tais como configurações do microscópio, condições de imagem e, no caso de experimentos operacionais ou in situ, mudanças no ambiente ou estímulos ^1,23. A análise precisa de grandes conjuntos de dados de TEM, sobre os quais esses parâmetros podem ser continuamente modificados, requer atenção significativa do operador para registrar com precisão cada condição e configuração para cada imagem em um diário de laboratório ou outra fonte de documentação externa. À medida que os conjuntos de dados TEM crescem em tamanho e complexidade, a manutenção manual de registros se torna incontrolável e as principais informações podem ser perdidas ou registradas de forma imprecisa. O software MVS descrito aqui consolida os metadados gerados durante um experimento a partir do microscópio, do detector/câmera e de outros sistemas (como porta-amostras in situ) e os alinha com suas respectivas imagens.

Além da consolidação de metadados, o software aplica algoritmos de visão mecânica para rastrear e estabilizar o campo de visão por meio de uma combinação de correções espaciais, de feixe e digitais usando suas funções Drift Correct e Focus Assist . Quando a função Drift Correct é ativada, uma imagem de ‘modelo’ de correlação cruzada é gerada usando a primeira imagem puxada para o software MVS. O modelo é então comparado com as imagens recebidas para calcular a direção e a magnitude da deriva ou movimento da amostra. Com essas informações, o software MVS aplica automaticamente as correções necessárias para manter as características da imagem no mesmo lugar, ajustando pelo menos um dos três parâmetros: localização do palco, mudança do feixe ou da imagem e correção digital da imagem. A função Focus Assist utiliza uma combinação de algoritmos para atribuir um valor de foco, chamado de pontuação de foco a cada imagem, e essas pontuações são comparadas para determinar a magnitude e a direção do ajuste de desfocagem a ser aplicado para manter a amostra em foco. No modo de imagem STEM, o software MVS tenta maximizar o contraste por meio de uma versão proprietária da variância normalizada para atribuir a pontuação de foco. No modo ETM, uma soma radial de intensidade é calculada no FFT e usada para calcular o escore de foco. Limitações na capacidade do software MVS de otimizar o foco ocorrem quando ele não consegue calcular com precisão a pontuação de foco correta para uma imagem. Isso geralmente ocorre quando o microscópio está desalinhado ou a amostra está significativamente fora de foco durante a calibração, impedindo que o software calcule corretamente o valor correto do escore de foco inicial. O software MVS pode ter dificuldade em calcular o escore de foco para amostras com franjas de rede bem definidas, pois as franjas de rede no FFT podem “sobrecarregar” o algoritmo de pontuação de foco; Assim, se uma amostra sair do foco, o escore de foco pode não refletir com precisão a mudança de foco. Por outro lado, trabalhar em ampliações baixas ou com uma amostra que tem um sinal FFT baixo também pode tornar desafiador calcular uma boa pontuação de foco. Para mitigar essas dificuldades, o software MVS contém uma série de algoritmos adicionais que podem ser selecionados pelo usuário para calcular a pontuação de foco se as configurações padrão não forem adequadas para a amostra. Estes devem ser testados e aplicados caso a caso para determinar os melhores algoritmos para um determinado experimento.

Mudanças morfológicas na estrutura da amostra ao longo do tempo são explicadas usando um fator de morfização de molde. Esse filtro é ajustável pelo operador, de modo que os algoritmos de registro levem em conta as mudanças morfológicas ao longo do tempo. Além disso, o software monitora a imagem contínua, as configurações do microscópio e as configurações da câmera ou do detector para atualizar automaticamente o molde quando acionado por mudanças na estrutura da amostra e após quaisquer alterações induzidas pelo operador nos parâmetros do microscópio, câmera ou detector. Como mostrado na Figura 4, Figura 5, Arquivo Suplementar 7 e Arquivo Suplementar 8, o software MVS fornece estabilização efetiva e imediata, permitindo imagens de alta resolução de amostras em movimento ou mudança dinâmicas. Embora o software seja capaz de controlar taxas muito altas de deriva ou movimento da amostra, como as que ocorrem ao aplicar uma rampa de aquecimento durante um experimento in situ , existem limitações para as correções máximas de estágio ou deslocamentos de feixe que o software pode controlar se a amostra está se movendo ou derivando muito rapidamente. Esse limite é uma função da taxa de atualização da imagem, do tamanho do campo de visão e da taxa de desvio. Para um determinado campo de visão e taxa de atualização de imagem, há uma taxa máxima de deriva que pode ser corrigida, e se os movimentos físicos não conseguem acompanhar, o processo pode terminar ou se tornar instável. A partir dos modelos de registro gerados quando recursos como Drift Correct são aplicados, metadados calculados adicionais podem ser gerados. Por exemplo, Correlação de correspondência é um registro numérico da extensão da mudança entre modelos em uma série e é usado para identificar pontos em uma linha do tempo experimental em que a amostra mudou. Um alto valor de correlação de correspondência corresponde a uma amostra que sofreu alterações em sua morfologia, e um baixo valor de correlação de correspondência corresponde a uma amostra cuja estrutura permanece relativamente estática. A correlação de correspondência é particularmente valiosa para estudos in situ , pois pode ser plotada graficamente, permitindo que o usuário identifique rapidamente imagens na série correspondente a uma mudança significativa na amostra. É importante, no entanto, entender que altos valores de correlações de correspondência também podem corresponder a mudanças nas condições de imagem, como mover o estágio ou alterar a ampliação, se essas ações forem executadas enquanto a função Correção de Desvio permanecer ativa.

O fluxo de trabalho de calibração apresentado aqui utiliza um suporte de calibração exclusivo e uma rotina de calibração semi-automatizada para calibrar com precisão o feixe sob uma variedade de condições de lente com intervenção mínima do operador. A rotina de calibração de dose é acessada através do software MVS instalado no MET. O software MVS lê automaticamente as configurações relevantes do microscópio para salvar todas as medições para referência para experimentos posteriores. Em alguns METs, não é possível ler as configurações de abertura ou monocromador, e estas devem ser inseridas nas configurações do software MVS pelo operador durante as calibrações e durante o uso. Há lembretes embutidos no software para ajudar a manter essas configurações de entrada do operador atualizadas seguindo os prompts do programa. O desenvolvimento de um suporte com um coletor de corrente embutido, em vez de depender de um integrado em outro lugar na coluna do microscópio, é uma escolha deliberada de projeto. Isso permite que o coletor de corrente seja posicionado no mesmo plano de uma amostra, eliminando erros na medição de corrente causados pela deflexão do feixe ou diferenças na absorção de elétrons por aberturas em diferentes posições do feixe. O software MVS segue uma rotina automatizada para medir a corrente e a área do feixe para qualquer combinação de condições de lente. O software pode então correlacionar essas calibrações medidas com a corrente da câmera ou da tela e extrapolar quaisquer mudanças na ampliação, etc., para a área do feixe durante o experimento. Uma vez gerados, esses arquivos de calibração podem ser usados imediatamente e são salvos automaticamente para uso posterior se o software detectar as mesmas configurações sendo usadas durante uma sessão futura. Embora a longevidade do arquivo de calibração varie de microscópio para microscópio, os autores descobriram que eles são capazes de usar os mesmos arquivos de calibração por vários meses sem observar mudanças substanciais nos valores atuais. Existem rotinas integradas monitorando o perfil de emissão das pistolas para ajudar a manter essas calibrações relevantes, especialmente em pistolas de emissão FEG frias.

A normalização das medidas de dose entre microscópios e o rastreamento automatizado da exposição do feixe de uma amostra são funções críticas do software MVS, pois permitem comparações quantitativas das condições de dose entre experimentos a serem realizados em diferentes sistemas de microscópios. A degradação induzida por dose de uma amostra de zeólita (ZSM-5), obtida durante experimentos idênticos usando microscópios diferentes, resulta no desaparecimento completo dos pontos FFT após uma dose máxima cumulativa ou limiar de elétrons (~60.000 e-/Å 2 ao aplicar uma taxa de dose de ~500 e^–/Ų·s) para ambas as configurações. Estes resultados comparativos demonstram que o software de dose facilita medidas quantitativas de dose reprodutíveis. A pequena diferença na dose cumulativa na qual o desaparecimento total do ponto FFT é observado para cada experimento é provavelmente resultado das diferentes tensões de aceleração empregadas pelos dois microscópios, com tensões de aceleração mais baixas resultando em mais vias de dano de radiação, e tensões de aceleração mais altas tipicamente resultando em mais danos de detonação²⁴. Os resultados da literatura para a dose crítica de nanopartículas de ZSM-5 variam de 9.000-14.000 e^–/Ų usando os primeiros desaparecimentos de pontos de FFT, em vez do desaparecimento completo de todos os pontos de FFT^25,26. Em nossos resultados, o primeiro desaparecimento do ponto FFT corresponde a uma dose cumulativa de cerca de 25.000 e^–/Ų. Estudos anteriores basearam-se em medidas de corrente obtidas usando uma tela de fósforo, que é bem documentada para subestimar as medidas de corrente do feixe quando comparadas a uma xícara de Faraday¹⁵. A dose crítica determinada pode variar por um fator de dois ou mais, dependendo de qual pico de FFT é usado para rastrear a dose. Isso indica que as frequências espaciais mais altas degradam primeiro, e podem resultar em valores diferentes dependendo do acesso à zona usada durante as medições (nossos resultados se concentraram em pontos FFT de todo o cristal de zeólita, em vez de características estruturais específicas)^25,26. Essas diferenças nas técnicas e na calibração atual explicam a diferença de valores entre os dois experimentos relatados em nossos resultados e estudos prévios da literatura.

Embora as interações de dose de elétrons sejam um fator significativo em muitos experimentos de MET, estudos in situ e especificamente líquido-EM são particularmente sensíveis aos seus efeitos. A radiólise de líquidos pelo feixe de elétrons resulta em uma cascata de espécies quimicamente reativas que podem interagir com a amostra, dificultando a análise. Tanto a taxa de dose ou fluência utilizada durante um experimento líquido-EM quanto a dose cumulativa podem influenciar na concentração de espécies de radicais geradas pela radiólise líquida^27,28. Assim, coletar e registrar metadados cumulativos de dose e taxa de dose ao longo de um experimento permite uma correlação direta entre as imagens e o histórico de doses de uma amostra, sendo uma maneira mais precisa de elucidar e controlar o impacto do feixe de elétrons nesses experimentos. Embora não abordado neste protocolo, um exemplo da utilidade dos recursos de gerenciamento de dose para EM líquido é mostrado na Figura 6.

Figura 6: Crescimento induzido por feixe de nanopartículas de ouro durante um experimento líquido-EM in situ. (A) Visão geral STEM de baixa ampliação do crescimento de partículas resultante com uma sobreposição de cores do mapa de dose cumulativa em toda a região. As áreas vermelhas na sobreposição indicam regiões de exposição cumulativa elevada à dose e as áreas amarelas indicam regiões de menor exposição. Realçar um pixel individual com o cursor ou desenhar uma caixa sobre uma área usando as ferramentas de desenho incluídas indica a dose cumulativa para esse pixel ou área. A barra de escala é de 2 μm. (B,C) Imagens STEM de maior ampliação das áreas indicadas pelas caixas laranjas (b,c) em A. A área b, exposta a uma dose cumulativa mais elevada (10,811 e-/Å 2) contém partículas maiores do que as encontradas na área c, que foi exposta a uma dose cumulativa mais baixa (0,032 e^–/Ų). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A taxa de dose enriquecida e os metadados de dose cumulativa simplificam a análise das vias de crescimento e degradação de nanomateriais dependentes da dose. A Figura 6 mostra a redução induzida por feixe de uma solução de íons cloreto áurico de ouro (HAuCl₃) em água durante experimentos líquido-EM. A partir da sobreposição do mapa de dose colorido na Figura 6A, é fácil visualizar que a dose cumulativa de elétrons influencia o tamanho e a forma resultantes das nanopartículas 29,30,31,32. A visão geral STEM de baixa ampliação mostra regiões expostas a uma dose cumulativa alta (vermelha) e baixa (amarela). As partículas na região exposta a doses mais altas são maiores do que as das regiões expostas a doses cumulativas mais baixas. Como os metadados de dose são diretamente incorporados em cada imagem no nível de pixel, os efeitos complexos da dose de elétrons em experimentos de EM líquido podem agora ser sistematicamente analisados de uma maneira nunca antes alcançável.

Neste protocolo, demonstramos que o software MVS fornece uma solução abrangente para calibrar, monitorar e rastrear tanto a dose de elétrons quanto a dose total entregue a uma amostra pixel a pixel. Essa capacidade desbloqueia um novo paradigma para a obtenção de imagens de amostras sensíveis à dose e para a compreensão das interações do feixe de elétrons. É particularmente empolgante para experimentos líquido-EM, pois permitirá uma interrogação mais eficaz sobre o papel que a dose de elétrons desempenha e melhorará a reprodutibilidade experimental. Esperamos que esta nova estrutura permita a coleta precisa de informações sobre a taxa de dose e a dose acumulada, facilite o compartilhamento desses dados com a comunidade para uma interpretação mais precisa dos resultados da TEM e avance a colaboração científica e o compartilhamento de dados, permitindo o relato e a análise dos principais FAIR.