이미징 마이크로플레이트에서 프리캐스트 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 하이드로겔을 사용하여 혈관화된 골수 틈새의 간단한 설정

그림 1 에는 다음과 같은 프로토콜 섹션이 요약되어 있습니다. 1. 3D 기질 단일 재배 확립 hBM-MSC 세포 현탁액을 준비한다.가습 분위기에서 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에서 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 5ng/mL FGF-2가 보충된 MEMα에서 hBM-MSC를 70%-90%의 합류 수준으로 성장시킵니다. 상기 세포는 계대 6까지 사용될 수 있다. 세포를 PBS로 세척하고, 37°C에서 3-5분 동안 0.05% Trypsin-EDTA를 사용하여 이들을 분리한다. 기본 배지(10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 MEMα)로 세척하여 분리 과정을 중지합니다. 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브에 부유 세포를 수집합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 현탁액의 총 세포 수를 결정합니다. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 적절한 부피의 기본 배지에 세포를 재현탁하여 1 x 107 cells/mL의 원액 농도를 달성합니다. 각 성장 인자(정의된 농도의 FGF-2 및 BMP-2, 예: 0ng/mL, 25ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL 또는 200ng/mL)가 보충된 필요한 부피의 기본 배지가 들어 있는 50mL 원추형 원심분리기 튜브를 준비합니다. 웰당 200μL가 필요합니다. 자동화된 액체 처리기를 사용하여 세포 파종을 수행해야 하는 경우 기기의 데드 볼륨도 고려하십시오. 수동 세포 파종의 경우 10 %를 초과하는 부피로 충분합니다. 1:66.67의 희석으로 원액에서 hBM-MSC를 추가하여 1.5 x 105 cells/mL의 농도를 달성합니다. 파종을 위해 접시를 준비하십시오.96-웰 하이드로겔 플레이트를 덮고 있는 폴리프로필렌 접착 필름을 제거한다. 하이드로겔을 덮고 있는 저장 완충액을 조심스럽게 흡인합니다. 이 작업에는 마이크로플레이트 와셔를 사용하십시오. 그러나 수동 처리가 가능합니다.수동 흡인기 또는 다채널 피펫을 사용할 때 팁을 웰 벽에 대고 버퍼를 흡입하면서 내부 웰의 가장자리를 향해 천천히 아래로 이동합니다. 이렇게 하면 하이드로겔 표면이 손상되는 것을 방지할 수 있습니다. 자동 플레이트 와셔를 사용할 때 흡인 노즐을 플레이트 캐리어에서 최소 3.8mm(하이드로겔 플레이트의 내부 링에서 0.8mm에 해당) 웰 가장자리 쪽으로 설정합니다. 자세한 지침과 96웰 하이드로겔 플레이트의 플레이트 도면을 얻으려면 제조업체 설명서를 참조하십시오. 세포가 균질하게 분포되도록 완전히 혼합한 후 1.1.7단계에서 제조된 세포 현탁액의 200μL/well을 추가합니다. 파종 중에 기질의 한 영역에서 세포의 고르지 않은 침전을 피하기 위해 플레이트를 기울이지 마십시오. 수동 파종의 경우, 혼합물을 균질하게 유지하기 위해 주기적으로 세포 현탁액 (3 개의 웰을 파종 한 후)을 혼합하십시오. 자동 파종의 경우, 동일한 수의 세포를 포함하는 부피를 분주하기 위해 분주 직전에 혈청학적 피펫과 혼합하십시오. 배양물을 가습 분위기에서 37°C 및 5%CO2 로 유지한다. 원하는 대로 5x 대물렌즈로 명시야 현미경으로 배양 진행을 모니터링합니다. 시드 후 약 30분 후에 참조 이미지를 획득하여 추가된 셀 수를 평가합니다. 2. 3D stromal-endothelial cell co-culture 확립 GFP-HUVEC 세포 현탁액을 준비한다.37°C에서 30분 동안 0.02M 아세트산에 150μg/mL 쥐꼬리 콜라겐 I로 구성된 용액으로 코팅하여 HUVEC 배양을 위한 플라스크를 준비합니다. 사용하기 전에 PBS로 한 번 헹굽니다. GFP-HUVECs를 37°C의 인큐베이터에서 10% FBS로 보충된 EGM-2에서 80%-100%의 합류 수준으로, 가습된 분위기에서 5%CO2 로 성장시킵니다. 상기 세포는 계대 7까지 사용될 수 있다. 세포를 PBS로 세척하고, 37°C에서 2-3분 동안 0.05% Trypsin-EDTA를 사용하여 이들을 분리한다. 기본 배지(10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 MEMα)로 세척하여 분리 과정을 중지합니다. 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브에 부유 세포를 수집합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 현탁액에 존재하는 총 세포 수를 결정합니다. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 적절한 부피의 기본 배지에 세포를 재현탁하여 1 x 107 cells/mL의 원액 농도를 달성합니다. 각 성장 인자(정의된 농도의 FGF-2 및 BMP-2, 예: 0ng/mL, 25ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL 또는 200ng/mL)가 보충된 필요한 부피의 기본 배지가 들어 있는 50mL 원추형 원추형 원심분리기 튜브를 준비합니다. 1.1.7 단계의 hBM-MSC에 대해 설명된 대로 1.5 x 105 cells/mL의 농도를 달성하기 위해 1:66.67의 희석으로 원액에서 GFP-HUVEC를 추가합니다. 단계 1.2.2에서 완충액 제거에 대해 기술된 바와 같이 기질 단일배양물을 함유하는 플레이트로부터 배지를 흡인한다. 단계 1.3에서 hBM-MSC 첨가에 대해 설명된 바와 같이 단계 2.1.8에서 제조된 GFP-HUVEC 세포 현탁액의 200μL/웰을 추가합니다. 가습된 분위기에서 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션한다. 3-4 일마다 배지를 교체하십시오. 원하는 대로 5x 대물렌즈를 사용하여 명시야 및 형광 현미경으로 배양 발달을 모니터링합니다. 초기 또는 중간 특성화를 위해 각각 또는 원하는 대로 공동 배양의 4일 또는 7일까지 배양을 유지합니다. 3. 특성화 절차 1: 내피 세포 네트워크 형성 정량화 원하는 시점에서, 정량화에 적합한 설정(즉, 더 넓은 시야를 위한 최적 초점, 고대비 및 저배율[예: 5x])을 사용하여 형광 현미경으로 GFP-HUVEC로부터 GFP 신호를 획득합니다. 대비를 더욱 향상시키기 위해 같은 날에 획득된 모든 이미지를 동일하게 사전 처리(예: Fiji32 사용). GFP 신호는 배양 시간에 따라 어두워질 수 있습니다. 따라서 다른 날짜에 획득한 이미지는 다른 처리가 필요할 수 있습니다.Fiji 또는 ImageJ를 사용하는 경우 동일한 시점의 모든 GFP 채널 이미지를 열고 밝기 및 대비 메뉴를 엽니다. 중간 조건(가장 어둡거나 가장 밝은 신호가 아님)을 나타내는 이미지를 선택하고 자동을 선택하여 대비를 자동 조정합니다. 설정(Set)을 선택하고 열려 있는 다른 모든 이미지로 전파(Propagate to all Open Images)를 선택합니다. 자동으로 선택된 범위가 현재 시점의 모든 이미지에 맞는지 시각적으로 평가하고 필요에 따라 수동으로 다시 조정하고 모든 이미지에 다시 전파합니다. 조정된 이미지를 TIF 파일로 저장하고 획득한 다른 시점에 대해 3.2.1단계와 3.2.2단계를 반복합니다. 모든 이미지에 중간 흐림 필터(예: 2048×2048 이미지의 경우 반경 3)를 적용하여 아티팩트 인식 다운스트림을 방지하여 정확한 네트워크 식별을 용이하게 합니다. 비닝(2×2)을 통해 크기를 줄이고 정량화를 위해 사전 처리된 모든 이미지를 그레이스케일 RGB 컬러 TIF 파일로 폴더에 저장합니다. 이러한 단계는 수동으로 수행하거나 작성자가 요청 시 공유할 매크로를 사용하여 배치 모드로 수행할 수 있습니다. 3.1-3.3단계에서 생성된 폴더의 모든 이미지를 ImageJ33용 혈관신생 분석기의 배치 프로세스 모드를 사용하여 분석합니다. 이미지 크기 및 사용 가능한 작업 메모리에 따라 이미지당 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 인식된 구조와 원본 이미지의 오버레이를 검사하여 정량화 결과를 검증합니다. 알고리즘이 원본 이미지에서 몇 개의 셀만 볼 수 있거나 전혀 볼 수 없는 인공 구조를 인식하는 경우 사전 처리 매개변수를 조정하고 원본 이미지를 다시 분석하거나 이러한 문제 영역을 제외하거나 분석에서 이미지를 복제합니다. 각 샘플의 값에 분석된 면적의 비율을 1mm2에 곱하여 얻은 값을1mm2의 면적으로 정규화합니다. 이 단계는 크기가 다른 이미지를 사용하는 경우 특히 중요합니다. 분석에서 총 네트워크 길이, 접합부 수, 세그먼트 수, 분리된 세그먼트 수, 분기 간격 및 평균 메쉬 크기와 같은 다양한 네트워크 파라미터를 추출하고 이를 사용하여 다양한 시점 및 다양한 배양 조건에서 내피 네트워크를 특성화합니다. 4. 특성화 절차 2 : ECM 증착 평가 원하는 종료 시점에서 면역형광을 사용하여 ECM 증착을 평가합니다. 아래에 설명된 바와 같이 배양의 마지막 6시간 동안 또는 고정 후 배양 배지 100μL에 다양한 ECM 분자에 대한 1차 항체를 추가합니다.RT에서 5분 동안 200μL/웰의 PBS로 배양물을 한 번 세척하고, RT에서 30분 동안 화학 흄 후드 아래에서 4% 파라포름알데히드의 100μL/웰로 고정합니다. 고정된 배양물을 RT에서 PBS 200μL/well로 매회 5분씩 3회 세척하고, PBS 200μL/well에 4°C에서 보관하거나 즉시 다음 단계로 진행한다. 고정 후 ECM 분자에 대한 1차 항체와 함께 배양하기 전에 RT에서 30분 동안 차단 용액으로 PBS에서 1% BSA의 200μL/well로 고정된 배양물을 배양합니다.블로킹 용액을 흡인하고 4°C에서 밤새 PBS에서 1% BSA의 1차 항체 용액 100μL/웰과 함께 배양합니다. 200μL/웰의 PBS로 실온에서 각각 5분, 최소 3시간 및 5분 동안 3회 세척합니다.참고: 결합되지 않은 항체가 하이드로겔 밖으로 완전히 확산되려면 긴 세척 단계가 필요합니다. 세포내 카운터스테인을 포함한 2차 염색 용액의 침투를 용이하게 하기 위해, 배양물의 세포 밀도에 따라 RT에서 30-90분 동안 PBS 중 0.3% Triton X-100 및 1% BSA를 사용하여 배양물을 투과시킨다.참고: 세포내 분자의 항체 기반 염색의 경우 이 단계는 4.1.2단계에 설명된 1차 항체로 배양하기 전에 수행해야 합니다. 각각의 2차 항체 및 대조염색(예: DAPI와 같은 핵 염색 및 팔로이딘-로다민과 같은 세포골격 염색)을 포함하는 2차 염색 용액을 준비합니다.0.1% Triton X-100, PBS 중 1% BSA 및 카운터스테인(예: 1μg/mL DAPI 및 1:4,000 팔로이딘-로다민)으로 구성된 염색 완충액을 준비하고 권장 희석액에 각각의 2차 항체를 추가합니다. 100 μL/well의 2차 염색 용액을 첨가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 1차 항체 배양 후 절차와 유사하게 RT에서 각각 5분, 최소 3시간 및 5분 동안 PBS 200μL/well로 3회 세척합니다. 구조물의 3D 분해를 위해 2.5 μm의 z 스텝으로 유리 바닥에서 시작하여 최종 높이 500 μm에 도달하는 컨포칼 스택을 획득하고, 10x 대물렌즈와 0.75x 디지털 줌을 사용합니다. 피지에서 GFP 및 F-액틴 신호의 3D 재구성을 생성하려면 합성물을 생성하고 Fiji 3D 뷰어를 사용하여 재구성을 생성하기 전에 각 채널을 개별적으로 임계값화합니다. 면역염색에서 증착된 ECM을 시각화하기 위해 5μm의 z-스텝, 10x 대물렌즈 및 1.5x 디지털 줌으로 100μm 높이의 컨포칼 스택을 획득합니다. 컴포지트를 만들기 전에 최대 강도 프로젝션을 생성하고 피지에서 각 채널의 밝기와 대비를 개별적으로 조정합니다. 세포 외 환경의 직접적인 색상 염색을 수행합니다.200μL/웰의 피크로시리우스 레드 염색 용액을 파라포름알데히드 고정 웰에 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 다음에, 염색된 웰을 증류수로 5회 세척하고, 샘플 색 투명화를 모니터링하면서 3-4일 동안 매일 또는 2일마다 2회 세척하였다. 긴 세척 단계(즉, 6시간을 초과하는 모든 것) 동안 플레이트를 4°C로 유지하십시오. 컬러 카메라가 장착된 명시야 현미경을 사용하여 염색된 샘플의 이미지를 획득하고 조건 전반에 걸쳐 동일한 화이트 밸런스를 유지합니다. 샘플의 개요를 얻으려면 저배율(예: 2.5x)을 사용하여 전체 웰을 스캔합니다. 현미경에 자동 스티칭을 지원하는 소프트웨어가 함께 제공되지 않는 경우 수동으로 수행하십시오(예: 피지34에서 페어와이즈 스티칭 사용).참고: 형광 이미지 획득이 완료된 경우 이전에 면역형광에 사용된 웰을 사용할 수 있습니다. 4.2.1-4.2.3 단계에서 Picrosirius Red 염색에 대해 설명한 것과 동일한 단계에 따라 Alizarin Red 염색, 세척 및 이미징을 수행합니다. 5. 특성화 절차 3: ALP 활성을 모니터링하여 골형성 분화 평가 서로 다른 배양 종료 시점(예: 공동 배양 4일 및 7일)에서 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP)/니트로 블루 테트라졸리움(NBT) 염색을 사용하여 ALP 활성을 정량적으로 평가합니다.BCIP/NBT 기질 용액으로 배양하기 전에 200μL/well의 PBS로 배양물을 한 번 세척하고 제조업체의 지침에 따라 준비해야 합니다. 37°C에서 배양하면서 주기적으로 발색을 모니터링합니다. 비골형성 조건에서 색이 발달하기 시작하면 4.1.1단계에서 설명한 대로 즉시 200% 파라포름알데히드로 고정하기 전에 PBS 4μL/well로 한 번 세척합니다. Picrosirius Red 염색을 위해 4.2.3 단계에 설명된 대로 염색된 샘플의 색상 이미지를 획득합니다. 상이한 배양 종료 시점 (예를 들어, 공동 배양의 4일째 및 7일째)에서, 세포 용해물에서 ALP 활성을 정량화한다.37°C에서 0.25% 트립신-EDTA의 200μL/웰로 배양하기 전에 200μL/웰의 PBS로 배양물을 3회 세척합니다. 10분마다 소화를 촉진하기 위해 위아래로 세게 피펫팅하여 배양물을 교반하고 표준 세포 배양 현미경으로 배양 형태를 모니터링합니다. 웰에서 길쭉한 세포 구조가 없는 액체 단일 세포 현탁액을 얻으면(일반적으로 20-30분 후) 샘플을 2mL 튜브로 옮기고 200μL의 MSC 기본 배지를 추가하여 트립신을 억제하고 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 회수된 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 경사 제거하고, 펠릿을 -80°C에서 동결시키거나, 단계 5.2.3으로 직접 진행한다. 5.2.2 단계에서 얻은 세포 펠렛을 해동하고 0.56 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol, 0.2% Triton X-100, pH 10으로 구성된 용해 완충액 500μL와 함께 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 다음에, 4°C에서 10분 동안 16,100 x g 로 원심분리하고, 샘플을 얼음 위에 보관한다. 단계 5.2.7에 기술된 측정 후, -20°C 또는 -80°C에서 샘플을 동결시키거나, 단계 5.2.8에 기술된 바와 같이, DNA 정량화를 직접 계속한다.참고: 용해 완충액은 미리 준비하고, 멸균 여과하고, 4°C에서 보관할 수 있습니다. 용해 완충액에서 20 mM 4-니트로페닐포스페이트 디소듐 염 육수화물 및 4 mMMgCl2 로 구성된 ALP 시약을 준비한다.참고: 이 용액은 정량화 당일에 신선하게 준비하는 것이 가장 좋습니다. 펠렛 파편을 방해하지 않고 5.2.3 단계에서 준비한 세포 용해물 상청액 50μL를 표준의 투명한 조직 배양 96웰 플레이트의 웰에 이중으로 분주합니다. 용해 버퍼를 두 개의 웰에 빈 컨트롤로 추가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 5.2.5단계에서 충진된 웰에 50μL/웰의 ALP 시약을 추가합니다. 플레이트를 짧게 흔들고, 빛으로부터 보호하면서 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다. ALP 활성이 높은 웰은 노란색으로 나타납니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 1M NaOH 100μL/웰을 추가하여 반응을 중지합니다. 플레이트 리더를 사용하여 410nm에서 광학 밀도를 읽습니다. 기술 중복의 평균을 구하고 빈 컨트롤의 평균을 뺍니다. DNA 정량화를 수행하여 전체 세포 수에 대해 이전 단계에서 결정된 ALP 활성을 정상화합니다. 여기서는 형광 측정에 기초한 방법이 설명되지만 세포 용해물에서 DNA 정량화를 위한 다른 방법은 분석과 호환됩니다. 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 DNA 정량에 필요한 시약 및 DNA 표준물질을 준비합니다.참고: DNA 표준물질을 준비하기 위해 용해 완충액을 사용하는 것이 좋습니다. 단계 5.2.3에 기술된 ALP 정량화에 사용된 샘플을 동결시킨 경우, 이들을 해동시키고, 4°C에서 2분 동안 16,100 x g 에서 원심분리하고, 얼음 위에 놓았다. 펠릿화된 파편을 방해하지 않고 50μL의 세포 용해물 상청액을 검은색 96웰 플레이트의 웰에 이중으로 분주합니다. -20°C 또는 -80°C에서 샘플을 동결하고 필요한 경우 ALP 및 DNA 정량화를 반복합니다. DNA 표준물질을 중복으로 추가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 50μL의 DNA 염색제를 첨가하고 배양한 후 제조업체의 지침에 따라 형광 강도를 판독합니다. 표준 곡선 값을 사용하여 측정된 강도 값의 변환을 결정하고 DNA 농도에 적용합니다. 5.2.7 단계에서 얻은 ALP 값을 각 샘플의 각 DNA 농도로 나누어 정규화합니다. 6. 적용 1 : 약물 감수성 분석 수행 내피 네트워크가 완전히 발달하면(일반적으로 간질-내피 세포 공동 배양의 4일째에) 베바시주맙과 같은 항혈관신생 화합물을 신선한 배양 배지의 배양물에 첨가하고 시간 경과에 따른 활성을 다른 조건(예: 다른 농도의 FGF-2 또는 BMP-2)에서 테스트합니다.그 시점까지 각 배양에 사용된 것과 동일한 성장 인자를 함유하는 신선한 배양 배지를 준비한다.관심 화합물의 희석제(예: 베바시주맙의 경우: 60mg/mL α-트레할로스 이수화물, 0.4mg/mL Tween20, 5.8mg/mL 인산나트륨, 일염기성 및 일수화물, 1.2mg/mL 인산나트륨 이염기성, 무수물)로 구성된 대조 용액을 준비하고 멸균 여과합니다. 관심 화합물을 원하는 농도(예: 10μg/mL 베바시주맙)로 추가하고 동일한 부피의 대조 용액을 각각 테스트 및 컨트롤 조건에 대해 지정된 배양 배지에 추가합니다. 배양물에서 배지를 흡인하고 6.1.1단계에서 새로 준비한 배지 200μL/웰을 추가합니다. 테스트할 화합물에 적합한 시간 동안 배양합니다(예: 베바시주맙의 경우: 2일). 배양 발달을 모니터링하고 섹션 3에 설명된 대로 내피 네트워크를 특성화합니다. 단계 3.7에 기술된 분석으로부터 추출된 GFP 이미지 및 정량적 네트워크 파라미터를 사용하여 혈관신생을 억제하거나 예비형성된 구조를 절제하는 데 있어서의 화합물의 효과를 평가한다. 7. 적용2 : 다양한 암세포 유형을 이용한 선진 공배양 시스템 구축 공동 배양 4일째에 내피 네트워크가 대부분 확립되면 MDA-MB-231 또는 U2OS 암 세포와 같은 다른 세포 유형을 신선한 배양 배지의 배양에 추가합니다.공동 배양에서 GFP 표지 HUVEC 및 표지되지 않은 hBM-MSC와 구별할 수 있도록 제조업체의 지침에 따라 세포 적합성 살아있는 염료를 사용하여 암세포에 라벨을 붙입니다. 그 시점까지 각 배양에 사용된 것과 동일한 성장 인자를 포함하는 신선한 배양 배지에서 1.5 x 104 cells/mL의 농도로 암세포 현탁액을 준비합니다. 원하는 대로 배양 발달 및 암세포 국소화를 모니터링합니다.참고: 암 유형, 활동 및 환경에 따라 간질-내피 세포 공동 배양에서 혈관 구조에 도달하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다(예: MDA-BM-231 및 U2OS의 경우 2일). 따라서 암-혈관 세포 상호작용을 시각화하기 위한 타임랩스 영상은 그에 따라 시간을 맞춰야 합니다.