イメージングマイクロプレート中のプレキャストポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルを用いた血管化骨形成骨髄ニッチの簡単な確立

図 1 は、以下のプロトコル セクションをまとめたものです。 1. 3D間質モノカルチャーの確立 hBM-MSC細胞懸濁液を調製する。10S、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および5 ng/mL FGF-2を添加したMEMα中で、加湿雰囲気中の37°Cおよび5%CO2 のインキュベーターでhBM-MSCを70%〜90%のコンフルエンスレベルまで増殖させます。細胞は継代6まで使用してもよい。 細胞をPBSで洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAを用いて37°Cで3〜5分間剥離します。 基礎培地(MEMαに10Sおよび1%ペニシリン – ストレプトマイシンを添加したもの)で洗い流すことによって剥離プロセスを停止します。懸濁した細胞を50 mLのコニカル遠心管に回収します。 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、懸濁液中の細胞の総数を決定します。 細胞を200 x g で5分間遠心分離してペレット化します。上清を慎重に取り除きます。 細胞を適切な量の基礎培地に再懸濁して、1 x 107 細胞/mLのストック溶液の濃度を達成します。 必要量の基礎培地(FGF-2およびBMP-2を規定の濃度、例えば0 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、または200 ng/mL)を含む50 mLコニカル遠心チューブを準備します。ウェルあたり、200 μLが必要です。自動リキッドハンドラーを使用して細胞播種を行う場合は、装置のデッドボリュームも考慮してください。手動の細胞播種の場合、10%を超える体積で十分です。 ストック溶液からhBM-MSCを1:66.67の希釈率で添加し、1.5 x 105 細胞/mLの濃度にします。 播種用のプレートを準備します。96ウェルハイドロゲルプレートを覆っているポリプロピレン接着フィルムをはがします。 ヒドロゲルを覆っている貯蔵バッファーを注意深く吸引します。この作業には、マイクロプレートウォッシャーを使用します。ただし、手動処理は可能です。手動アスピレーターまたはマルチチャンネルピペットを使用する場合は、チップをウェルの壁に当て、バッファーを吸引しながら、ウェルの内側の端に向かってゆっくりと下に移動します。これにより、ヒドロゲル表面の損傷が回避されます。 自動プレートウォッシャーを使用する場合は、吸引ノズルをプレートキャリアから少なくとも3.8 mm(これはヒドロゲルプレートの内輪から0.8 mmに相当)およびウェルの端に向けて設定します。より詳細な手順および96ウェルヒドロゲルプレートのプレート図を入手するには、製造元のマニュアルを参照してください。 ステップ1.1.7で調製した細胞懸濁液を200 μL/ウェル加え、十分に混合した後、細胞が均一に分布するようにします。播種中は、基質の1つの領域における細胞の不均一な沈降を避けるために、プレートを傾けないでください。手動播種の場合は、混合物を均一に保つために(3つのウェルを播種した後)細胞懸濁液を定期的に混合する。自動播種の場合は、分注直前に血清学的ピペットと混合して、同数の細胞を含む容量を分注します。 培養物を加湿雰囲気中で37°Cおよび5%CO2 に維持する。 必要に応じて、5倍の対物レンズを備えた明視野顕微鏡で培養の発達を監視します。播種後約30分で参照画像を取得し、添加細胞数を評価します。 2. 3次元間質-内皮細胞共培養の確立 GFP-HUVEC細胞懸濁液を調製します。150 μg/mL ラットテールコラーゲン I を 0.02 M 酢酸溶液で 37 °C で 30 分間コーティングすることにより、HUVEC 培養用のフラスコを準備します。 使用前にPBSで一度すすいでください。 GFP-HUVECをEGM-2で80%〜100%のコンフルエンスレベルまで成長させ、37°Cのインキュベーターで10Sを、加湿雰囲気で5%CO2 を添加します。細胞は継代7まで使用してもよい。 細胞をPBSで洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAを用いて37°Cで2〜3分間剥離します。 基礎培地(MEMαに10Sおよび1%ペニシリン – ストレプトマイシンを添加したもの)で洗い流すことによって剥離プロセスを停止します。懸濁した細胞を50 mLのコニカル遠心管に回収します。 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、懸濁液中に存在する細胞の総数を決定します。 細胞を200 x g で5分間遠心分離してペレット化します。上清を慎重に取り除きます。 細胞を適切な量の基礎培地に再懸濁して、1 x 107 細胞/mLのストック溶液の濃度を達成します。 ステップ1.1.6でhBM-MSCについて説明しましたように、それぞれの成長因子(定義された濃度のFGF-2およびBMP-2、たとえば、0 ng / mL、25 ng / mL、50 ng / mL、100 ng / mL、または200 ng / mL)を添加した必要量の基礎培地を含む50 mLのコニカル遠心チューブを準備します。 ステップ1.1.7でhBM-MSCについて説明したように、ストック溶液からGFP-HUVECを1:66.67の希釈で添加して、1.5 x 105 細胞/mLの濃度を達成します。 間質単培養を含むプレートから培地を吸引します(ステップ1.2.2でバッファー除去について説明したように)。 ステップ1.3のhBM-MSC添加について説明したように、ステップ2.1.8で調製したGFP-HUVEC細胞懸濁液を200 μL/ウェル加えます。 加湿雰囲気中で37°C、5%CO2 でインキュベートします。3〜4日ごとに培地を交換してください。 必要に応じて、5倍の対物レンズを使用して明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡で培養の進展を監視します。初期または中間の特性評価のために、共培養の4日目または7日目まで、それぞれ、または所望に応じて培養を維持する。 3.特性評価手順1:内皮細胞ネットワーク形成の定量化 目的の時点で、定量化に適した設定(すなわち、最高の焦点、高コントラスト、および低倍率(例えば、より広い視野のための5倍))を使用して、蛍光顕微鏡でGFP-HUVECからGFP信号を取得します。 同じ日に取得したすべての画像を均等に前処理して(たとえば、フィジー32を使用)、コントラストをさらに高めます。GFPシグナルは培養時間とともに暗くなる可能性があることに注意してください。したがって、異なる日に取得された画像は、異なる処理を必要とする場合があります。フィジーまたはImageJを使用している場合は、同じ時点のすべてのGFPチャンネル画像を開き、 明るさとコントラスト メニューを開きます。中間条件(最も暗い信号でも明るい信号でもない)を表す画像を選択し、[自動]を選択してコントラストを 自動調整します。[ 設定] を選択し、[ 開いている他のすべてのイメージに反映する] をオンにします。 自動的に選択された範囲が現在の時点のすべての画像に適合するかどうかを視覚的に評価し、必要に応じて手動で再調整してすべての画像に再伝播します。 調整した画像をTIFファイルとして保存し、取得した他の時間ポイントに対して手順3.2.1と手順3.2.2を繰り返します。 すべての画像にメディアンぼかしフィルター(たとえば、2048×2048画像の場合は半径3)を適用して、下流のアーティファクト認識を回避し、正確なネットワーク識別を容易にします。ビニング(2×2)でサイズを縮小し、すべての前処理された画像をグレースケールRGBカラーTIFファイルとして定量化用のフォルダーに保存します。これらの手順は、手動またはバッチモードで、作成者が要求に応じて共有するマクロを使用して実行できます。 手順3.1-3.3で作成したフォルダ内のすべての画像を、ImageJ33用血管新生分析装置のバッチ処理モードを使用して解析します。イメージのサイズと使用可能な作業メモリによっては、イメージごとに数分かかる場合があることに注意してください。 認識された構造と元の画像のオーバーレイを調べることにより、定量化結果を検証します。アルゴリズムが、元の画像に少数の細胞しか見られない、またはまったく見えない人工構造を認識する場合は、前処理パラメータを調整し、元の画像を再分析するか、そのような問題のある領域を除外したり、画像を分析から複製したりします。 各サンプルの値に分析面積と1 mm2の比率を掛けて、得られた値を1 mm2の面積に正規化します。この手順は、異なるサイズの画像を使用する場合に特に重要です。 解析から、ネットワーク全体の長さ、ジャンクション数、セグメント数、孤立セグメント数、分岐間隔、平均メッシュサイズなどのさまざまなネットワークパラメータを抽出し、それらを使用して、さまざまな時点およびさまざまな培養条件下での内皮ネットワークの特性評価を行います。 4. 特性評価手順2:ECM堆積の評価 目的の終了時点で、免疫蛍光を使用してECM沈着を評価します。以下に説明するように、培養の最後の6時間中または固定後に、100 μLの培養液にさまざまなECM分子に対する一次抗体を追加します。培養物を200 μL/ウェルのPBSでRTで5分間1回洗浄し、100 μL/ウェルの4%パラホルムアルデヒドで化学ヒュームフードの下でRTで30分間固定します。 このステップでは周囲の培養物が損傷する可能性があるため、プレートのすべてのウェルを同時に固定することをお勧めします。固定培養物を200 μL/ウェルのPBSでRTで3回ずつ5分間洗浄し、200 μL/ウェルのPBSで4°Cで保存するか、すぐに次のステップに進みます。 固定後にECM分子に対する一次抗体とインキュベートする前に、ブロッキング溶液としてPBS中の1%BSAの200 μL/ウェルで固定培養物をRTで30分間インキュベートします。ブロッキング溶液を吸引し、PBS中の1%BSA中の100 μL/ウェルの一次抗体溶液とともに4°Cで一晩インキュベートします。 200 μL/ウェルのPBSで、RTでそれぞれ5分間、少なくとも3時間、および5分間、3回洗浄します。注:ヒドロゲルから未結合抗体を完全に拡散させるには、長い洗浄ステップが必要です。 細胞内対比染色を含む二次染色溶液の浸透を促進するために、培養物の細胞密度に応じて、PBS中の0.3%Triton X-100および1%BSAを使用して、RTで30〜90分間培養物を透過処理します。注:細胞内分子の抗体ベースの染色の場合、このステップは、ステップ4.1.2で説明した一次抗体とのインキュベーションの前に実行する必要があります。 それぞれの二次抗体を含む二次染色液を調製し、所望により対比染色剤(例えば、DAPIなどの核染色剤やファロイジン・ローダミンなどの細胞骨格染色剤など)を調製します。PBS中の0.1%Triton X-100、1%BSAからなる染色バッファーを調製し、対比染色(例:1 μg/mL DAPIおよび1:4,000ファロイジン-ローダミン)し、それぞれの二次抗体を推奨希釈液で添加します。 100 μL/ウェルの二次染色液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 一次抗体インキュベーション後の手順と同様に、200 μL/ウェルのPBSで5分間、少なくとも3時間、および5分間、RTでそれぞれ3回洗浄します。 構造の3D解像度には、ガラス底部から2.5 μmのzステップで最終高さ500 μmに達する共焦点スタックを取得し、10倍の対物レンズと0.75倍のデジタルズームを使用します。フィジーでGFPおよびF-アクチン信号の3D再構成を生成するには、コンポジットを作成してFiji 3D Viewerを使用して再構成を生成する前に、各チャンネルを個別にしきい値化します。 免疫染色から沈着したECMを可視化するには、高さ100 μmの共焦点スタックを5 μmのzステップ、10倍の対物レンズ、1.5倍のデジタルズームで取得します。コンポジットを作成する前に、フィジーで最大強度の投影を生成し、各チャンネルの明るさとコントラストを個別に調整します。 細胞外環境の直接色染色を行います。200 μL/ウェルのピクロシリウスレッド染色溶液をパラホルムアルデヒド固定ウェルに加え、RTで1時間インキュベートします。 次に、染色したウェルを蒸留水で5回洗浄し、続いてサンプルの色透明化を監視しながら3〜4日間、毎日または2日ごとに2回洗浄します。長時間の洗浄ステップ(つまり、6時間を超えるもの)の間は、プレートを4°Cに保ちます。 カラーカメラを搭載した明視野顕微鏡で染色サンプルの画像を取得し、条件全体で均一なホワイトバランスを維持します。サンプルの概要を取得するには、低倍率(2.5倍など)を使用してウェル全体をスキャンします。顕微鏡に自動ステッチングをサポートするソフトウェアが付属していない場合は、手動で行います(たとえば、フィジー34のペアワイズステッチングを使用します)。注:蛍光画像の取得が完了していれば、以前に免疫蛍光に使用されたウェルをこれに使用できます。 手順4.2.1-4.2.3のピクロシリウスレッド染色で説明したのと同じ手順に従って、アリザリンレッド染色、洗浄、およびイメージングを実行します。 5.特性評価手順3:ALP活性のモニタリングによる骨形成分化の評価 異なる培養終了時点(共培養の4日目と7日目など)で、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)/ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)染色を使用してALP活性を定量的に評価します。培養液を200 μL/ウェルのPBSで1回洗浄してから、製造元の指示に従って調製したBCIP/NBT基質溶液でインキュベートしてください。発色を定期的にモニタリングしながら37°Cでインキュベートします。非骨形成状態で色が発達し始めたら、ステップ4.1.1で説明されているように、4%パラホルムアルデヒドで固定する前に、すぐに200 μL/ウェルのPBSで1回洗浄します。 ピクロシリウスレッド染色のステップ4.2.3で説明したように、染色されたサンプルのカラー画像を取得します。 異なる培養終了時点(例えば、共培養の4日目および7日目)において、細胞溶解物中のALP活性を定量化する。培養液を200 μL/ウェルのPBSで3回洗浄した後、200 μL/ウェルの0.25%トリプシン-EDTAを37°Cでインキュベートします。 10分ごとに、消化を促進するために上下に激しくピペッティングして培養物を攪拌し、標準的な細胞培養顕微鏡で培養形態をモニターします。 ウェル内に細長い細胞構造を持たない液体の単一細胞懸濁液が得られたら(通常20〜30分後)、サンプルを2 mLチューブに移し、トリプシンを抑制するために200 μLのMSC基礎培地を加え、500 x g で5分間遠心分離して、回収した細胞をペレット化します。上清をデカントし、ペレットを-80°Cで凍結するか、ステップ5.2.3に直接進みます。 ステップ5.2.2で得られた細胞ペレットを解凍し、0.56 M 2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、0.2% Triton X-100、pH 10からなる500 μLの溶解バッファーとともに、氷上で30分間インキュベートします。次に、16,100 x g で4°Cで10分間遠心分離し、サンプルを氷上に保ちます。ステップ5.2.7で説明した測定の後、サンプルを-20°Cまたは-80°Cで凍結するか、ステップ5.2.8で説明したようにDNA定量を直接続行します。注:溶解バッファーは、事前に調製し、滅菌ろ過し、4°Cで保存することができます。 溶解バッファー中で20 mM 4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物と4 mM MgCl2 からなるALP試薬を調製します。注:定量当日にこの溶液を新鮮に調製するのが最善です。 ペレット状の破片を乱すことなく、ステップ5.2.3で調製した細胞ライセート上清50 μLを、標準的な透明な組織培養96ウェルプレートのウェルに二重に分注します。溶解バッファーをブランクコントロールとして2つのウェルに加えます。 マルチチャンネルピペットを使用して、ステップ5.2.5で充填したウェルに50 μL/ウェルのALP試薬を追加します。プレートを短時間振とうし、光から保護しながら37°Cで10分間インキュベートします。ALP活性が高いウェルは黄色で表示されます。マルチチャンネルピペットを使用して1 M NaOHを100 μL/ウェル添加して反応を停止します。 プレートリーダーを使用して410nmでの光学濃度を読み取ります。技術的な重複を平均し、空白のコントロールの平均を減算します。 DNA定量を行い、前のステップで決定したALP活性を全細胞数に対して正規化する。ここでは、蛍光測定に基づく方法が記載されているが、細胞ライセート中のDNA定量のための他の任意の方法は、アッセイに適合する。DNA定量に必要な試薬やDNA標準物質は、市販のキットを使用し、メーカーの指示に従って調製してください。注:DNA標準物質の調製には溶解バッファーを使用することをお勧めします。 手順5.2.3で説明したALP定量に使用したサンプルが凍結されている場合は、解凍し、16,100 x g で4°Cで2分間遠心分離し、氷上に置きます。ペレット状の破片を乱すことなく、50 μLの細胞ライセート上清を黒色の96ウェルプレートのウェルに二重に分注します。サンプルを-20°Cまたは-80°Cで凍結し、必要に応じてALPおよびDNA定量を繰り返します。DNA標準を重複して追加します。 マルチチャンネルピペットで、50 μLのDNA染色剤を添加し、インキュベートして、製造元の指示に従って蛍光強度を読み取ります。検量線値を使用して、測定された強度値のDNA濃度への変換を決定し、適用します。 ステップ5.2.7で得られたALP値を、各サンプルのそれぞれのDNA濃度で割って正規化します。 6.アプリケーション1:薬剤感受性アッセイの実施 内皮ネットワークが完全に発達したら(通常、間質-内皮細胞共培養の4日目に)、ベバシズマブなどの抗血管新生化合物を新鮮な培養培地の培養物に加え、経時的に異なる条件下で(例えば、異なる濃度のFGF-2またはBMP-2)でそれらの活性をテストします。それまでそれぞれの培養に用いたのと同じ成長因子を含む新鮮な培養液を調製する。目的化合物の希釈液(例:ベバシズマブの場合:60 mg/mL α-トレハロース二水和物、0.4 mg/mL Tween20、5.8 mg/mLリン酸ナトリウム、一塩基性および一水和物、1.2 mg/mLリン酸ナトリウム二塩基性無水物)からなる対照溶液を調製し、滅菌ろ過します。 目的の化合物を所望の濃度(例:10 μg/mLベバシズマブ)で、等量のコントロール溶液を、それぞれ試験条件とコントロール条件に指定された培地に加えます。 培養液から培地を吸引し、ステップ6.1.1で調製したばかりの培地200 μL/ウェルを追加します。試験する化合物に適した時間インキュベートします(例:ベバシズマブの場合:2日間)。培養の発達を監視し、セクション3に記載されているように内皮ネットワークを特徴付けます。GFP画像とステップ3.7で説明した分析から抽出された定量的ネットワークパラメータを使用して、血管新生の阻害または事前に形成された構造のアブレーションにおける化合物の有効性を評価します。 7. 応用2:多様ながん細胞との高度な共培養系の構築 共培養の4日目に、内皮ネットワークがほとんど確立されたら、MDA-MB-231またはU2OSがん細胞などの他の細胞タイプを新鮮な培地での培養物に追加します。共培養中のGFP標識HUVECおよび非標識hBM-MSCと区別できるようにするために、製造元の指示に従って細胞適合性の生色素を使用して癌細胞を標識します。 それまでそれぞれの培養に使用していたのと同じ成長因子を含む新鮮な培養液に、1.5 x 104 cells/mLの濃度の癌細胞の懸濁液を調製します。 必要に応じて、培養の進展とがん細胞の局在をモニターします。注:がんの種類、活動、環境によっては、間質-内皮細胞共培養で血管構造に到達するまでに数日かかる場合があります(例:MDA-BM-231およびU2OSの場合は2日)。したがって、がんと血管細胞の相互作用を視覚化するためのタイムラプスイメージングは、それに応じてタイミングを合わせる必要があります。