Reproduzierbarkeit und Harmonisierung in der Forschung mit biologischen Standards: Das Beispiel des Thrombozytenagonisten-Kollagen-verwandten Peptids
Summary
In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Standardisierung des Thrombozytenagonisten-Kollagen-verwandten Peptids Cross-Linked (CRP-XL) mittels Lichttransmissionsaggregometrie vor. Während das Protokoll auf die Thrombozytenfunktion abzielt, kann das experimentelle Verfahren auf die meisten biologischen Moleküle und Bioassays angewendet werden, um wissenschaftliche Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
Abstract
Metrologie – die Wissenschaft des Messens – ist ein Thema, über das nur wenige Biowissenschaftler in ihrer Ausbildung unterrichtet werden, zu ihrem Nachteil; Die Anwendung einfacher Standardisierungsprozesse auf die tägliche Arbeitspraxis schafft Vertrauen in Daten und Reproduzierbarkeit über Distanz und Zeit.
Diese Methode zeigt, wie ein Kernlaborexperiment standardisiert werden kann, das in der Hämostaseforschung und in der klinischen Praxis weit verbreitet ist, insbesondere die Messung der Reaktionen auf das Thrombozyten-Kollagenrezeptor (Glykoprotein [GP]VI)-Agonisten-Kollagen-verwandte Peptid, vernetzt (CRP-XL) durch Lichttransmissionsaggregometrie (LTA). Die Verwendung dieses Ansatzes gewährleistet die Reproduzierbarkeit innerhalb des Labors und die Harmonisierung zwischen den Laboren, unabhängig vom Agonistenbestand oder dem Lieferanten. Wichtig ist, dass diese Methode auf andere Thrombozytenagonisten und in der Tat auf viele andere biologische Moleküle und Bioassays anwendbar ist.
Der unten beschriebene Prozess beinhaltet die Erstellung einer 6-8-Punkt-Verdünnungsreihe des “Standards” und des “Tests” (das Material, das Sie überprüfen) und deren Gegenüberstellung in einem ausgewählten Assay (in diesem Fall LTA). CRP-XL wird bei Masse-/Volumenkonzentrationen verwendet, aber nicht jedes Material weist bei einer bestimmten Konzentration die gleiche biologische Aktivität auf, so dass eine Verdünnungsreihe erstellt wird, um das Standard- und Testmaterial zu vergleichen und zu bestimmen, welche Konzentration erforderlich ist, um eine gleichwertige Aktivität zu erzielen. Die Verdünnungsreihe muss eine Aggregation von 0 bis 100 % umfassen. Die Daten werden mit Hilfe der nichtlinearen Regression aufgetragen, und der EC50-Wert jeder Probe (Standard und Test) wird bestimmt. Um die Aktivität zuzuordnen, dividieren Sie den EC50-Wert des Standards durch den Wert des Tests, um zu bestimmen, wie viel mehr oder weniger wirksam er ist, und passen Sie die Konzentration entsprechend an. Dieser Ansatz stellt sicher, dass dem Assay immer wieder die gleiche biologische “Aktivität” hinzugefügt wird.
Introduction
Viele von uns verwenden biologische Agonisten und Antagonisten in ihren Experimenten, meist in einem biologischen Assay, der ihre Wirkung auf die Zellfunktion unter bestimmten Bedingungen quantifiziert. Das hier beschriebene Verfahren gilt für den Thrombozytenagonisten Kollagen-verwandtes Peptid, vernetzt (CRP-XL), einen Glykoprotein-VI-Agonisten, der Blutplättchen aktiviert und dessen Aktivität in einer Vielzahl von Assays gemessen werden kann (Lichttransmissionsaggregometrie, Mikroskopie, Durchflusszytometrie,Ca2+ -Freisetzung usw.), aber das Agonisten-Standardisierungsprotokoll ist auf jeden biologischen Agonisten/Antagonisten und/oder Bioassay anwendbar. Die Naturwissenschaften sind mit der Verwendung von Standards in ihrer täglichen Arbeitspraxis bestens vertraut, und Unternehmen, die biotherapeutische Arzneimittel im kommerziellen Bereich entwickeln, verstehen den Wert der Verwendung von Referenzstandards1, aber sie werden von vielen Biowissenschaftlern, insbesondere in der akademischen Forschungsgemeinschaft, nach wie vor nicht ausreichend genutzt, und ihre mangelnde Verwendung wirkt sich negativ auf die Qualität der wissenschaftlichen Ergebnisse aus.
CRP-XL ist ein spezifischer GPVI-spezifischer Agonist, der seit seiner Beschreibung im Jahr 1995 seit Jahrzehnten im Thrombozytenfeld verwendet wird2 und der der Gemeinschaft hilft, die Rolle von GPVI von der anderer kollagenbindender Thrombozytenproteine abzugrenzen 3,4. Dieser Agonist kann aus einer Vielzahl von kommerziellen Quellen bezogen oder im eigenen Haus hergestellt werden. Das Peptidmonomer kann von einem Lieferanten erworben und dann intern vernetzt werden, oder dies kann vom Lieferanten gegen eine zusätzliche Gebühr durchgeführt werden. Weitere Kosteneinsparungen lassen sich erzielen, indem die erforderliche Reinheit bei der Auslieferung reduziert wird (z. B. 70 % gegenüber 95 %). Es gibt auch keinen Konsens darüber, wie CRP-XL gelagert werden sollte, wobei sich einige für die Kryolagerung und andere für die Kühlung entscheiden, einige das Material bis zur Verwendung lyophilisiert halten und wieder andere es in Lösung (Wasser oder Puffer, je nach Präferenz) lagern. Daher sind die Qualität und Zusammensetzung von Laborvorräten nicht standardisiert oder harmonisiert. Da dieser Agonist in einer definierten Konzentration (Masse/Volumen) und nicht in Aktivitätseinheiten verwendet wird, ist die Wirksamkeit von CRP-XL in einem Labor, z. B. bei 1 μg/ml, nicht die gleiche wie in einem anderen. Es ist erwähnenswert, dass andere Thrombozytenagonisten, die in diesem Bereich verwendet werden, bereits standardisiert sind (z. B. Thrombin, das in Aktivitätseinheiten und nicht in Masse/Volumen geliefert und verwendet wird), so dass der Übergang von Masse/Volumen zu Einheiten von biologischem Material für die Gemeinschaft keine allzu große Herausforderung darstellen sollte. Es sollte auch beachtet werden, dass das Ansprechen von Patienten auf Thrombozytenagonisten, einschließlich CRP-XL, in Bezug auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Agonisten sowie auf ihre Fähigkeit zum Ansprechen (Ausmaß des Ansprechens) variabel ist5, so dass es umso wichtiger ist, konsistente Mengen an Agonistenaktivität in den Assays zu verwenden.
Wenn Thrombozytenagonisten harmonisiert werden können, indem sie bei einer definierten Aktivität und nicht bei Gewicht/Volumen verwendet werden, kann sichergestellt werden, dass ein Experiment in einem Labor direkt mit dem in anderen Labors vergleichbar ist und mit Sicherheit genau reproduziert werden kann. Bis zu dem Zeitpunkt, an dem sich das Feld über die Lagerung und Standardisierung der CRP-XL-Aktivität geeinigt hat, ist es wichtig, regelmäßige Kontrollen des Materials durchzuführen, um seine Konsistenz über die Monate/Jahre, in denen es verwendet wird, sicherzustellen.
Die Zuweisung von Aktivitätswerten für biologische Standards muss durch kollaborative, multizentrische Studien erfolgen (z. B. 6,7) und erfordert Fachwissen. Die Notwendigkeit etablierter biologischer Standards für Thrombozytenagonisten wurde kürzlich durch eine kollaborative multizentrische Studie8 hervorgehoben, die von der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase (ISTH) unterstützt wurde. Bis ein internationaler CRP-XL-Standard verfügbar ist, können Forscher ihr eigenes Material lokal standardisieren, um die Konsistenz im Laufe der Zeit zu gewährleisten, und dass neues Material, das kommerziell oder intern beschafft wird, von vergleichbarer Aktivität ist wie frühere Präparate sowie die des Rests der Gemeinschaft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie hier gezeigt, ist der Prozess der Standardisierung der Materialien sehr einfach. Obwohl es ein wenig Zeit in Anspruch nimmt, neue Materialchargen zu bewerten und/oder zu überprüfen, ob die aktuelle Charge stabil ist und im Laufe der Zeit nicht an Aktivität verliert, besteht die Belohnung darin, dass die Experimente immer wieder reproduzierbar und über Jahre hinweg vergleichbar sind und nicht nur die Lebensdauer einer Reagenzcharge. Es bedeutet auch, dass andere Forscher die Assay-Bedingungen genau nachbilden können und dass die Gemeinschaft auf globaler Ebene harmonisiert ist. Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die Vollblutentnahme und die PRP-Aufbereitung9 sowie die Präzision bei der Erstellung der Verdünnungsreihe. Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass die Test- und Standardkurven parallel sind, bevor Sie mit dem EC50-Vergleich fortfahren. Wenn die Linien nicht parallel sind oder die Asymptoten nicht äquivalent sind, könnte dies darauf hindeuten, dass sich das Test- und das Standardmaterial bis zu einem gewissen Grad unterscheiden.
Jeder, der in den Biowissenschaften arbeitet, weiß, dass biologische Assays nicht immer konsistent funktionieren, daher muss man dies bei der Auswertung der Daten berücksichtigen. In dem hier gezeigten Beispiel sind die Hanghänge und Asymptoten nicht identisch, obwohl wir dieselben Donatoren verwenden, um die Potenz von zwei sehr ähnlichen, wenn nicht sogar identischen Materialien zu messen. Dennoch akzeptieren wir ein gewisses Maß an Variabilität und kommen zu dem Schluss, dass die Kurven in diesem Fall parallel sind und daher geeignet sind, die Potenz zu vergleichen und anzupassen. Biologische Moleküle sind groß und komplex, und posttranslationale Modifikationen während der Herstellung können ihre Wirksamkeit in Bioassays beeinflussen. Die Standardisierung von Biomolekülen und Bioassays kann nicht nur anhand von Masse oder Volumen erfolgen, sondern muss durch Quantifizierung und Vergleich der biologischen Aktivität in einem Bioassay erfolgen11. Man muss seine/ihre Ausbildung und Erfahrung nutzen, um die Daten im Kontext des Assays zu bewerten.
Die Einschränkungen der Technik bestehen darin, dass die Daten zwar auf ein Problem mit dem/den Reagenz(en) hinweisen können, aber nicht sagen können, was das Problem ist. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um festzustellen, warum die Materialien nicht vergleichbar sind. In einer idealen Welt würde jegliches Material, das für Experimente und nachfolgende wissenschaftliche Schlussfolgerungen entscheidend ist, durch Massenspektroskopie verifiziert werden, aber das ist nicht immer eine Option. Wenn die Daten jedoch nicht vergleichbar sind, sind weitere Untersuchungen in gewisser Weise dennoch gerechtfertigt. Eine weitere Einschränkung dieses Ansatzes ist der Zeit- und Ressourcenaufwand. Im Idealfall sollten der Test und der Standard bei 3-6 Spendern verglichen werden, um ein gewisses Vertrauen in die Zuordnung der biologischen Aktivität des Materials zu schaffen, aber wir sind der Meinung, dass dies durch die Unterstützung der Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit gerechtfertigt ist. Die Standardisierung von biologischem Material ist nicht jedes Mal erforderlich, wenn Experimente durchgeführt werden, aber sie sollte zumindest für jede neue Charge von Agonisten durchgeführt werden, vorzugsweise häufiger, je nach Stabilität und Verwendung. Sollte eine Norm zur Verfügung gestellt werden, können internationale Normungsorganisationen Klarheit schaffen.
Während das hier gezeigte Beispiel für CRP-XL im Zusammenhang mit der Messung der Thrombozytenaggregation gilt, ist das Protokoll zum Vergleich der biologischen Aktivität von Biomolekülen in Bioassays branchenweit verbreitet.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
| 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
| Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis software package | |
| Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |
Referenzen
- Faya, P., et al. Potency assignment of biotherapeutic reference standards. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577 (2020).
- Morton, L. F., et al. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity. The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).
- Pugh, N., et al. Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood. Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).
- Farndale, R. W., et al. Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).
- Dunster, J. L., et al. Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts. Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).
- Hubbard, A. R., et al. Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).
- Sergaki, C., et al. Developing whole cell standards for the microbiome field. Microbiome. 10 (1), 123 (2022).
- Alessi, M. C., et al. Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).
- Taylor, L., et al. Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing. PLoS One. 9 (6), e101209 (2014).
- Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. Applying the science of measurement to biology: Why bother. PLoS Biology. 17 (6), e3000338 (2019).
