Riproducibilità e armonizzazione nella ricerca utilizzando standard biologici: l'esempio del peptide correlato al collagene agonista piastrinico
Summary
Qui presentiamo un metodo per standardizzare il peptide correlato al collagene agonista piastrinico cross-linked (CRP-XL) utilizzando l’aggregometria a trasmissione luminosa. Sebbene il protocollo sia mirato alla funzione piastrinica, il processo sperimentale può essere applicato alla maggior parte delle molecole biologiche e dei saggi biologici per garantire rigore scientifico e riproducibilità.
Abstract
La metrologia – la scienza della misura – è una materia che pochi scienziati biologici vengono istruiti nella loro formazione a loro danno; L’applicazione di semplici processi di standardizzazione alle pratiche di lavoro quotidiane fornisce fiducia nei dati e riproducibilità a distanza e nel tempo.
Questo metodo dimostra come standardizzare un esperimento di laboratorio di base ampiamente utilizzato nella ricerca sull’emostasi e nella pratica clinica, in particolare, misurando le risposte al peptide correlato al collagene agonista del recettore piastrinico (glicoproteina [GP]VI), reticolato (CRP-XL) mediante aggregometria a trasmissione luminosa (LTA). L’utilizzo di questo approccio garantirà la riproducibilità intra-laboratorio e l’armonizzazione inter-laboratorio, indipendentemente dallo stock o dal fornitore di agonisti. È importante sottolineare che questo metodo è applicabile ad altri agonisti piastrinici e, in effetti, a molte altre molecole biologiche e saggi biologici.
Il processo descritto di seguito prevede la creazione di una serie di diluizioni a 6-8 punti dello “standard” e del “test” (il materiale che si sta controllando) e l’esecuzione fianco a fianco in un saggio scelto (in questo caso, LTA). Il CRP-XL viene utilizzato a concentrazioni di massa/volume, ma non tutti i materiali danno la stessa attività biologica a una data concentrazione, quindi viene effettuata una serie di diluizioni per confrontare il materiale standard e quello di prova e determinare quale concentrazione è necessaria per dare un’attività equivalente. La serie di diluizione deve estendersi da 0 a 100% di aggregazione. I dati vengono tracciati utilizzando la regressione non lineare e viene determinato il valore EC50 di ciascun campione (standard e test). Per assegnare l’attività, dividere il valore EC50 dello standard per quello del test per determinare quanto è più o meno potente e regolare la concentrazione di conseguenza. Questo approccio garantirà che la stessa “attività” biologica venga aggiunta al test più e più volte.
Introduction
Molti di noi usano agonisti e antagonisti biologici nei nostri esperimenti, il più delle volte in un saggio biologico che quantifica il loro effetto sulla funzione cellulare in condizioni specifiche. Il metodo qui descritto è per l’agonista piastrinico collagene-related peptide, cross-linked (CRP-XL), un agonista della glicoproteina VI che attiva le piastrine e la cui attività può essere misurata in una varietà di saggi (aggregometria a trasmissione luminosa, microscopia, citometria a flusso, rilascio di Ca2+ , ecc.), ma il protocollo di standardizzazione dell’agonista è applicabile a qualsiasi agonista/antagonista biologico e/o biodosaggio. Le scienze fisiche sono esperte nell’uso degli standard nelle loro pratiche di lavoro quotidiane e le aziende che sviluppano farmaci bioterapeutici nel settore commerciale comprendono il valore dell’utilizzo di standard di riferimento1, ma rimangono sottoutilizzati da molti scienziati biologici, specialmente nella comunità di ricerca accademica, e la loro mancanza di utilizzo ha un impatto negativo sulla qualità della produzione scientifica.
CRP-XL è un agonista specifico specifico per GPVI che il campo piastrinico ha utilizzato per decenni dalla sua descrizione nel 19952, aiutando la comunità a delineare il ruolo di GPVI da quello di altre proteine piastriniche leganti il collagenesin da 3,4. Questo agonista può essere procurato da una varietà di fonti commerciali o prodotto internamente. Il monomero peptidico può essere acquistato da un fornitore e poi reticolato internamente oppure può essere fatto dal fornitore a un costo aggiuntivo. Un ulteriore risparmio sui costi può essere ottenuto riducendo la purezza richiesta al momento della consegna (70% contro 95%, ad esempio). Inoltre, non c’è consenso su come il CRP-XL dovrebbe essere conservato, con alcuni che optano per la crioconservazione e altri per la refrigerazione, alcuni mantengono il materiale liofilizzato fino all’uso e altri lo conservano in soluzione (acqua o tampone, a seconda delle preferenze). Pertanto, la qualità e la composizione delle scorte di laboratorio non sono standardizzate o armonizzate. Poiché questo agonista viene utilizzato a una concentrazione definita (massa/volume) piuttosto che a unità di attività, la potenza di CRP-XL in un laboratorio, ad esempio a 1 μg/mL, non sarà la stessa di un altro. Vale la pena notare che altri agonisti piastrinici utilizzati nel campo sono già standardizzati (ad esempio, la trombina, che viene fornita e utilizzata in unità di attività piuttosto che in massa/volume), quindi il passaggio da massa/volume a unità di biologico non dovrebbe essere troppo impegnativo per la comunità. Va inoltre notato che le risposte dei pazienti agli agonisti piastrinici, inclusa la CRP-XL, sono variabili in termini di sensibilità agli agonisti e di capacità di risposta (entità della risposta)5, quindi è ancora più importante utilizzare quantità costanti di attività agonista nei test.
Se gli agonisti piastrinici possono essere armonizzati utilizzandoli in un’attività definita piuttosto che in peso/volume, si può garantire che un esperimento in un laboratorio sia direttamente paragonabile a quello in altri laboratori e possa essere riprodotto accuratamente con sicurezza. Fino a quando il settore non raggiungerà un accordo su come immagazzinare e standardizzare l’attività di CRP-XL, è essenziale eseguire controlli regolari sul materiale per garantirne la coerenza nel corso dei mesi/anni in cui viene utilizzato.
L’assegnazione del valore di attività per gli standard biologici deve essere effettuata attraverso studi collaborativi multicentrici (ad esempio 6,7) e richiede competenze specialistiche. La necessità di stabilire standard biologici per gli agonisti piastrinici è stata recentemente evidenziata da uno studio multicentrico collaborativo8 sostenuto dalla Società Internazionale per la Trombosi e l’Emostasi (ISTH); fino a quando non sarà disponibile uno standard internazionale CRP-XL, i ricercatori possono standardizzare il proprio materiale a livello locale per garantire la coerenza nel tempo e che il nuovo materiale proveniente commercialmente o internamente sia di attività paragonabile alle preparazioni precedenti, così come a quelle del resto della comunità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come mostrato qui, il processo di standardizzazione dei materiali è molto semplice. Sebbene richieda un po’ di tempo per valutare nuovi lotti di materiale e/o per verificare che il lotto corrente sia stabile e non perda attività nel tempo, la ricompensa è che gli esperimenti sono riproducibili più e più volte e confrontabili nel corso degli anni piuttosto che solo la durata di un lotto di reagenti. Significa anche che altri ricercatori possono ricreare accuratamente le condizioni del saggio e che la comunità è armonizzata a livello globale. Le fasi critiche del protocollo includono la raccolta del sangue intero e la preparazione del PRP9, nonché la precisione durante la realizzazione della serie di diluizione. È inoltre importante assicurarsi che le curve di prova e standard siano parallele prima di procedere con il confronto EC50 . Se le linee non sono parallele o gli asintoti non sono equivalenti, potrebbe indicare che il materiale di prova e quello standard sono diversi in una certa misura.
Chiunque lavori nelle scienze biologiche sa che i saggi biologici non sempre funzionano in modo coerente, quindi è necessario essere consapevoli di questo quando si valutano i dati. Nell’esempio mostrato qui, anche se stiamo usando gli stessi donatori per misurare la potenza di due materiali molto simili, se non identici, i pendii e gli asintoti della collina non sono identici. Tuttavia, accettiamo un certo grado di variabilità e concludiamo che le curve sono, in questo caso, parallele, e quindi adatte per confrontare e regolare la potenza. Le molecole biologiche sono grandi e complesse e le modifiche post-traduzionali durante la produzione possono influenzare la loro potenza nei saggi biologici. La standardizzazione delle biomolecole e dei saggi biologici non può essere effettuata utilizzando solo la massa o il volume e deve essere effettuata quantificando e confrontando l’attività biologica in un test biologico11. È necessario utilizzare la propria formazione ed esperienza per valutare i dati nel contesto del saggio.
I limiti della tecnica sono che, sebbene i dati possano indicare un problema con i reagenti, non possono indicare quale sia il problema. Saranno necessari ulteriori studi per determinare il motivo per cui i materiali non sono comparabili. In un mondo ideale, qualsiasi materiale critico per gli esperimenti e le successive conclusioni scientifiche verrebbe verificato mediante spettroscopia di massa, ma questa non è sempre un’opzione. Tuttavia, se i dati non sono comparabili, sono comunque necessarie ulteriori indagini. Un altro limite di questo approccio è il tempo e le risorse necessarie per farlo. Idealmente, il test e lo standard dovrebbero essere confrontati in 3-6 donatori per fornire una certa sicurezza nell’assegnazione dell’attività biologica al materiale, ma riteniamo che ciò sia giustificato dal supporto della riproducibilità e dell’affidabilità. La standardizzazione del materiale biologico non è necessaria ogni volta che vengono eseguiti esperimenti, ma come minimo, dovrebbe essere fatta per ogni nuovo lotto di agonisti, preferibilmente più frequentemente, a seconda della stabilità e dell’uso. In effetti, se uno standard dovesse essere reso disponibile, questo è qualcosa su cui le organizzazioni internazionali di standardizzazione possono fare chiarezza.
Mentre l’esempio mostrato qui è per CRP-XL nel contesto della misurazione dell’aggregazione piastrinica, il protocollo di confronto dell’attività biologica delle biomolecole nei saggi biologici è ampiamente applicabile in tutto il settore.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
| 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
| Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis software package | |
| Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |
Referenzen
- Faya, P., et al. Potency assignment of biotherapeutic reference standards. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577 (2020).
- Morton, L. F., et al. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity. The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).
- Pugh, N., et al. Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood. Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).
- Farndale, R. W., et al. Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).
- Dunster, J. L., et al. Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts. Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).
- Hubbard, A. R., et al. Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).
- Sergaki, C., et al. Developing whole cell standards for the microbiome field. Microbiome. 10 (1), 123 (2022).
- Alessi, M. C., et al. Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).
- Taylor, L., et al. Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing. PLoS One. 9 (6), e101209 (2014).
- Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. Applying the science of measurement to biology: Why bother. PLoS Biology. 17 (6), e3000338 (2019).
