Reproductibilité et harmonisation dans la recherche à l’aide d’étalons biologiques : l’exemple du peptide associé au collagène agoniste plaquettaire
Summary
Nous présentons ici une méthode pour standardiser le peptide réticulé lié au collagène agoniste plaquettaire (CRP-XL) à l’aide de l’agrégation par transmission de la lumière. Bien que le protocole soit axé sur la fonction plaquettaire, le processus expérimental peut être appliqué à la plupart des molécules biologiques et des essais biologiques afin d’assurer la rigueur scientifique et la reproductibilité.
Abstract
La métrologie – la science de la mesure – est un sujet que peu de biologistes apprennent dans leur formation à leur détriment ; L’application de processus de standardisation simples aux pratiques de travail quotidiennes permet d’avoir confiance dans les données et d’assurer la reproductibilité à distance et dans le temps.
Cette méthode montre comment normaliser une expérience de laboratoire de base largement utilisée dans la recherche sur l’hémostase et la pratique clinique, en particulier, en mesurant les réponses au peptide lié au collagène agoniste du récepteur du collagène plaquettaire (glycoprotéine [GP]VI), réticulé (CRP-XL) par agrégation de transmission de la lumière (LTA). L’utilisation de cette approche assurera la reproductibilité intra-laboratoire et l’harmonisation inter-laboratoire, quel que soit le stock d’agonistes ou le fournisseur. Il est important de noter que cette méthode est applicable à d’autres agonistes plaquettaires et, en fait, à de nombreuses autres molécules biologiques et essais biologiques.
Le processus décrit ci-dessous consiste à faire une série de dilution de 6 à 8 points de la « norme » et du « test » (le matériau que vous vérifiez) et à les exécuter côte à côte dans un test choisi (dans ce cas, LTA). Le CRP-XL est utilisé à des concentrations massiques/volumiques, mais tous les matériaux ne donnent pas la même activité biologique à une concentration donnée, de sorte qu’une série de dilution est effectuée pour comparer l’étalon et le matériau d’essai et déterminer quelle concentration est nécessaire pour donner une activité équivalente. La série de dilution doit couvrir une agrégation de 0 à 100 %. Les données sont tracées à l’aide d’une régression non linéaire et la valeur EC50 de chaque échantillon (étalon et test) est déterminée. Pour attribuer l’activité, divisez la valeur EC50 de l’étalon par celle de l’essai pour déterminer sa puissance plus ou moins élevée et ajustez la concentration en conséquence. Cette approche garantira que la même « activité » biologique est ajoutée à l’essai encore et encore.
Introduction
Beaucoup d’entre nous utilisent des agonistes et des antagonistes biologiques dans nos expériences, le plus souvent dans un test biologique qui quantifie leur effet sur la fonction cellulaire dans des conditions spécifiques. La méthode décrite ici concerne le peptide réticulé (CRP-XL), un agoniste de la glycoprotéine VI qui active les plaquettes et dont l’activité peut être mesurée dans une variété de tests (agrégation par transmission de lumière, microscopie, cytométrie en flux, libération de Ca2+ , etc.), mais le protocole de standardisation des agonistes est applicable à tout agoniste/antagoniste biologique et/ou essai biologique. Les sciences physiques connaissent bien l’utilisation des normes dans leurs pratiques de travail quotidiennes, et les entreprises qui développent des médicaments biothérapeutiques dans le secteur commercial comprennent la valeur de l’utilisation d’étalons de référence1, mais elles restent sous-utilisées par de nombreux scientifiques en biologie, en particulier dans la communauté de la recherche universitaire, et leur manque d’utilisation a un impact négatif sur la qualité de la production scientifique.
CRP-XL est un agoniste spécifique du GPVI que le domaine plaquettaire utilise depuis des décennies depuis sa description en 19952, aidant la communauté à délimiter le rôle du GPVI de celui des autres protéines plaquettaires de liaison au collagène depuis 3,4. Cet agoniste peut être obtenu auprès de diverses sources commerciales ou produit en interne. Le monomère peptidique peut être acheté auprès d’un fournisseur, puis réticulé en interne, ou cela peut être fait par le fournisseur moyennant des frais supplémentaires. Des économies supplémentaires peuvent être réalisées en réduisant la pureté requise à la livraison (70 % contre 95 %, par exemple). Il n’y a pas non plus de consensus sur la façon dont le CRP-XL devrait être stocké, certains optant pour le stockage cryogénique et d’autres la réfrigération, certains gardant le matériau lyophilisé jusqu’à son utilisation, et d’autres le stockant en solution (eau ou tampon, selon les préférences). Par conséquent, la qualité et la composition des stocks de laboratoire ne sont ni normalisées ni harmonisées. Étant donné que cet agoniste est utilisé à une concentration définie (masse/volume) plutôt qu’à des unités d’activité, la puissance de la CRP-XL dans un laboratoire, par exemple à 1 μg/mL, ne sera pas la même qu’un autre. Il convient de noter que d’autres agonistes plaquettaires utilisés dans le domaine sont déjà normalisés (par exemple, la thrombine, qui est fournie et utilisée en unités d’activité plutôt qu’en masse/volume), de sorte que le passage de la masse/volume aux unités biologiques ne devrait pas être trop difficile pour la communauté. Il convient également de noter que les réponses des patients aux agonistes plaquettaires, y compris la CRP-XL, sont variables en termes de sensibilité aux agonistes ainsi que de capacité de réponse (étendue de la réponse)5, il est donc encore plus important d’utiliser des quantités constantes d’activité agoniste dans les tests.
Si les agonistes plaquettaires peuvent être harmonisés en les utilisant à une activité définie plutôt qu’à un poids/volume, on peut s’assurer qu’une expérience dans un laboratoire est directement comparable à celle d’autres laboratoires et peut être reproduite avec précision et confiance. Jusqu’à ce que le terrain parvienne à un accord sur la façon de stocker et de normaliser l’activité du CRP-XL, il est essentiel d’effectuer des contrôles réguliers sur le matériau pour s’assurer de sa cohérence au cours des mois/années au cours desquels il est utilisé.
L’attribution de la valeur de l’activité pour les étalons biologiques doit être effectuée par le biais d’études collaboratives et multicentriques (par exemple 6,7) et nécessite une expertise spécialisée. La nécessité d’établir des normes biologiques pour les agonistes plaquettaires a récemment été mise en évidence par une étude multicentrique collaborative8 soutenue par la Société internationale de thrombose et d’hémostase (ISTH) ; Jusqu’à ce qu’une norme internationale CRP-XL soit disponible, les chercheurs peuvent normaliser leur propre matériel localement pour assurer la cohérence dans le temps, et que le nouveau matériel provenant du commerce ou de l’interne a une activité comparable à celle des préparations précédentes, ainsi qu’à celle du reste de la communauté.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme le montre ici, le processus de normalisation des matériaux est très simple. Bien qu’il faille un peu de temps pour évaluer de nouveaux lots de matériel et/ou pour vérifier que le lot actuel est stable et ne perd pas d’activité au fil du temps, la récompense est que les expériences sont reproductibles à maintes reprises et comparables sur des années plutôt que sur la durée de vie d’un lot de réactif. Cela signifie également que d’autres chercheurs peuvent recréer avec précision les conditions d’analyse et que la communauté est harmonisée au niveau mondial. Les étapes critiques du protocole comprennent le prélèvement de sang total et la préparation du PRP9, ainsi que la précision lors de la réalisation de la série de dilution. Il est également important de s’assurer que les courbes d’essai et d’étalon sont parallèles avant de procéder à la comparaison EC50 . Si les lignes ne sont pas parallèles ou si les asymptotes ne sont pas équivalentes, cela peut indiquer que le matériau de test et le matériau standard sont différents dans une certaine mesure.
Tous ceux qui travaillent dans le domaine des sciences biologiques savent que les tests biologiques ne fonctionnent pas toujours de manière cohérente, il faut donc en tenir compte lors de l’évaluation des données. Dans l’exemple présenté ici, même si nous utilisons les mêmes donneurs pour mesurer la puissance de deux matériaux très similaires, sinon identiques, les pentes et les asymptotes ne sont pas identiques. Cependant, nous acceptons un certain degré de variabilité et concluons que les courbes sont, dans ce cas, parallèles, et donc adaptées à la comparaison et à l’ajustement de la puissance. Les molécules biologiques sont volumineuses et complexes, et les modifications post-traductionnelles au cours de la fabrication peuvent influencer leur puissance dans les essais biologiques. La normalisation des biomolécules et des essais biologiques ne peut pas se faire uniquement en utilisant la masse ou le volume et doit se faire en quantifiant et en comparant l’activité biologique dans un essai biologique11. Il faut utiliser sa formation et son expérience pour évaluer les données dans le contexte de l’essai.
Les limites de la technique sont que, bien que les données puissent indiquer un problème avec le(s) réactif(s), elles ne peuvent pas vous dire quel est le problème. D’autres travaux seront nécessaires pour déterminer pourquoi les matériaux ne sont pas comparables. Dans un monde idéal, tout matériau essentiel pour les expériences et les conclusions scientifiques ultérieures serait vérifié par spectroscopie de masse, mais ce n’est pas toujours une option. Toutefois, si les données ne sont pas comparables, une enquête plus approfondie est toujours justifiée dans une certaine mesure. Une autre limite de cette approche est le temps et les ressources nécessaires pour la mettre en œuvre. Idéalement, le test et la norme devraient être comparés chez 3 à 6 donneurs pour fournir une certaine confiance dans l’attribution de l’activité biologique au matériel, mais nous pensons que cela est justifié par le soutien de la reproductibilité et de la fiabilité. Il n’est pas nécessaire de normaliser le matériel biologique à chaque fois que des expériences sont menées, mais au minimum, cela devrait être fait pour chaque nouveau lot d’agonistes, de préférence plus fréquemment, en fonction de la stabilité et de l’utilisation. En effet, si une norme est mise à disposition, les organismes internationaux de normalisation peuvent apporter des éclaircissements à ce sujet.
Bien que l’exemple présenté ici soit pour la CRP-XL dans le contexte de la mesure de l’agrégation plaquettaire, le protocole de comparaison de l’activité biologique des biomolécules dans les essais biologiques est largement applicable dans l’ensemble du secteur.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| 4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
| 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
| Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis software package | |
| Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |
Referenzen
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