管理された条件下でのキャベツホワイトバタフライ(Pieris rapae)の飼育:重金属耐性のケーススタディ

この研究は、USDA APHIS許可P526P-13-02979の下で実施されました。 1.実験蝶のコレクション 空中防虫ネットで大人の女性の蝶を捕まえます。キャベツホワイトは一般に、蜜植物と宿主植物(アブラナ科)が存在する、開放的で乱れた生息地で見られます。太陽が出ていて気温が高いときに検索します。女性をターゲットにするには、ゆっくりと地面の近くで羽ばたき、植物に着地して前足骨で葉を「太鼓」(味わう)する個体を探します。 卵を収穫するためにケージに女性を設置します。注:野外で採集された雌は、平均して1〜2匹の雄12と交尾しており、捕獲後すぐに受精卵の産卵を開始する必要があります。野生の雌は産卵と交尾に自然光を必要とするので、ケージを温室または窓辺に置きます。 卵を収穫するために宿主植物を持つ雌を飼う。注:雌は、緑キャベツ、大根、ケール、コラード、 シロイヌナズナなどのさまざまな宿主植物を受け入れますが、植物が農薬で処理されていないことを確認してください。花の水管に入ったケールの茎など、葉の圧力を維持するために、鉢または水を入れた容器に宿主植物を提示します。 研究者が卵を集めて直接食事に移したい場合は、最初に輪ゴムを使用して宿主植物の葉をプラスチックのコップの水の上に取り付け、次に端の周りにパラフィルムを引き伸ばします-葉に触れる女性はパラフィルムに産卵します(5を参照)。 ケージには、鉢植えの植物に毎日水をやったり、特に乾燥した状態でタオルを濡らしたりするなど、相対湿度を高く保つためのものも含まれていることを確認してください。鉢植えの植物にケージで水をやる場合は、蝶が溜まった水に引っかかる可能性があるため、タオルが鉢の下にあることを確認してください。 特に経験豊富な個人と一緒に収容されている場合、蝶はすぐに使用することを学ぶ黄色のスポンジの上に提示された10%希釈蜂蜜水溶液で蝶を養う。蝶がスポンジから餌をやるのを奨励するには、特に水筒を軽くスプレーした後、蝶をフィーダーに直接置きます。 フィーダーをセットアップするには、まず黄色またはオレンジ色のスポンジを完全にすすぎ、次に60 mmのプラスチック製ペトリ皿に収まる小さな正方形に切ります。フィーダーを毎日交換し、マイルドな漂白剤溶液でスポンジを洗浄し、カビの成長を防ぐために徹底的にすすぎます。 2.人工食を作る まず、 表 1 のレシピまたはその他の関連ソースを使用して、実験に関連するレシピを決定します。焦点種または実験に固有の必要な変更を加えます。材料を計量する際に従うレシピを印刷します。 寒天を除くすべての乾燥成分を1つの容器に入れます。いくつかの成分が4°Cで保管されていることに注意して、成分がそれぞれの保管場所に戻されていることを確認し、事前に計量した乾燥成分混合物を5mLの亜麻仁油を入れたブレンダーに入れます。 ダイエットバッチごとに、以下に詳述する手順に従います。15 gの細かいメッシュの寒天と400 mLの蒸留水を、少なくとも1 Lの大きさのビーカーで混合します。寒天が沸騰に近づくまで電子レンジで加熱し、混合物全体に細かい泡を付け、沸騰を防ぐために30〜60秒ごとに混合物を攪拌します。 この熱い寒天混合物に、ビタミン混合物は熱に敏感であるため、400mLの蛇口温度の蒸留水を加えて、乾燥成分と混合するのに適切な温度にします。 寒天混合物をブレンダーに加えて完全に混合し、必要に応じてブレンダーの端をこすります。 寒天が加熱されているので、端が触れている状態でカウンターに少なくとも74オンスのダイエットカップを置きます。食事を完全に混合した後、ブレンダーからダイエットカップに混合物を注ぎ、食事が各カップの底を覆うようにします。 ダイエットが冷めたら、カップに蓋をしてダイエットカップにダイエットタイプのラベルを付けてトレーに積み重ね、使用するまで4°Cで最大1ヶ月間保存します。 3.人工食の移用と飼育 ハウスホスト植物は、24°Cの気候チャンバーでメッシュカバー付きの30オンスのデリカップに蝶の卵を残します。1週間後、カップをチェックします-幼虫が孵化し、1齢後半または2齢期初期に、人工食への移行に適した時期であることを確認します。 幼虫を絵筆で人工食に移し、漂白剤スプレーで消毒し、幼虫の容器の間に水すすぎます。3匹の幼虫を各4オンスカップに移します。人工食はエネルギー密度が高く、高密度の幼虫を支えることができますが、幼虫密度の高いカップでは病気やカビが広がる可能性があるため、幼虫をカップに詰めることは避けてください。 カップを側面のプラスチックビンに入れて、フラスがカップの底に落ちて食事から離れるようにし、カビや病気のリスクを減らします。ダイエットカップは、低から中程度の光レベルの制御された温度条件で収容します。透明なカップの蓋を覗いて、1〜2日ごとにカップのカビや病気を監視します。 カビや病気のカップは、他のカップへの拡散を防ぐために隔離または冷凍することができます。 4.成虫の出現と取り扱い 幼虫が蛹化してダイエットカップに出てくるのを待ちます。成虫が出てきたら、羽が固まるまで数時間待ってから、マーキングのために羽を取り除きます。羽をそっとつかんで、きれいな手でカップから成虫の蝶を取り除き、4つの羽すべてを体に近づける方が安定したホールドであることに注意してください。 蝶に印を付けるには、乾いた個体を頭と胸部で持ち、先端の細かいシャーピーを使用して後翅に数字を軽くマークします。翼のマーキングと性器の組み合わせを使用する性別の個人。メスは一般に背側前翅に2つの黒い斑点があり、後翅はより暗く黄色がかっていますが、オスは通常、背側前翅に明るい白い背景に1つの小さな黒い斑点があります54。 この色は個人差や季節差があることから、腹部の特徴で性別を確認する – 男性は腹部の遠位端に2つの留め金を持ち、一般的に腹部は狭く、女性は生殖器の開口部が1つある。 片手で封筒を開き、蝶を頭と胸部で持ち、封筒に滑り込ませ、もう一方の手で封筒を通して羽をつかむことにより、大人をワックスグラシン封筒に移します。封筒内で4つの翼がすべて正常に閉じていることを確認してください。 実験前に蝶を低温状態(5〜6°C)で最大1週間維持しますが、冷蔵庫から取り出したときに少なくとも1日は順応させます。 5. パフォーマンス対策 死んだ個体の翅の特徴を測定するには、片手で胸部を持ち、鉗子を使用してその基部の各翅を取り除くことにより、蝶の羽を取り除きます。翼をライトボックスに平らに置き、後で測定するために写真を撮ります。 繁殖力の推定値を取得するには、成虫を交配ケージに収容し、オスの生殖成熟に少なくとも1日、交尾に1日を許可します。解剖による卵数の設定された時点で雌を犠牲にするか、宿主植物で毎日卵を収集します。 卵の負荷を推定するには、女性の腹部を取り除き、1x PBSバッファーに入れ、腹側に沿ってスリットを切ります。鉗子を使用して内臓をキューティクルから分離し、卵巣を腸、気管、および腹部の他の内容物から引き離します。 2つの卵巣のそれぞれにある4つのカールした卵巣をほどき、成熟した卵、卵黄、殻のある卵が未熟な卵胞に移行する場所に注目します。カウンターを使用して、一般的に0〜200個の卵の範囲の成熟卵の合計を集計するのに役立ちます。 解剖された女性の交配状態を判断するには、滑液包の丘疹を開き、その中の精母細胞を分離します。精母細胞が消化されると、それらは一般的に「尾」を発達させ、互いに入れ子になります。 6. ケーススタディ 注:成虫の雌のキャベツシロチョウは、実験集団を見つけるために2014年に野生から収集されました。成体の雌はカリフォルニア州デイビス近郊から生まれた(N = 8人の創設雌)。 蝶の飼育温室内の自然光の下で「BugDorm」メッシュケージ(61 cm x 61 cm x 61 cm)に女性を収容します。宿主植物キャベツ(アブラナ属)の有機葉を産卵用に提供する。 ケージ内の湿度を維持するために、毎日水をやり、各ケージ内のタオルの上に置く小さな鉢植えの植物(コスモス)を含めます。 新しい卵の入った葉を蓋に穴の開いた473 mLのプラスチックカップに移して毎日卵を集め、気候室に入れます。 毎日交換される小さなペトリ皿の黄色いスポンジを通してアクセスできる10%蜂蜜水溶液(有機蜂蜜を蒸留水で希釈することによって作られた)への 自由な アクセスを蝶に提供します。 人工食の準備以前に開発された鱗翅目の食事の修正を使用して、キャベツの白い幼虫のための人工飼料を準備します4.1バッチの食事には、小麦胚芽50 g、カゼイン27 g、セルロース10 g、スクロース24 g、キャベツ粉15 g、ウェッソン塩ミックス9 g、トルラ酵母12 g、コレステロール3.6 g、ヴァンデルザントビタミンミックス10.5 g、メチルパラベン1.1 g、ソルビン酸1.5 gが含まれていました。 3 gのアスコルビン酸、および0.175 gのストレプトマイシン( 材料表を参照)。 複数のダイエットバッチ(表1)の乾燥成分を事前に計量し、完全に混合してダイエットタイプ間の均一性を高めてから、金属溶液と混合するために別々のバッチに細分化します。 乾燥成分を亜麻仁油と対応する金属混合物を入れたブレンダーに入れます。注:亜麻仁油は、過去の昆虫飼料提供者によって販売されていたため、本実験で使用されました。現在、同じ植物から作られた有機亜麻仁油が独占的に使用されていますが、亜麻仁油の商業提供者として添加物が含まれている可能性は低いです。 準備した食事を118 mL(4オンス)のプラスチック製デリカップに注ぎます。可溶性金属塩を使用して、焦点金属を人工食に加えます。植物の金属含有量(例えば、ニッケル蓄積55,56,57または植物の道端汚染58,59,60)の以前の観察と他の鱗翅目49,50,51の金属の耐性に基づいて金属濃度を目指します。 人工食に加えるために対応する量を服用する前に、金属塩を500〜1,000mLの蒸留水に溶かします。例えば、100 ppmのニッケル食を作るには、ブレンドする前に人工食に317.6 mLの1 M NiCl2 溶液を加えて、最終食濃度を100 mg/gのNi乾燥重量(約53 mg/g湿重量)にします。この量は、誘導結合プラズマ原子発光分光法に基づく平均測定濃度109.6ppm(表2)に相当します。注:金属のレベルは、ミネソタ大学の研究分析研究所によって6つのサンプルで推定されました。 メンテナンス宿主植物で収穫された卵を気候チャンバーで23°C、14:10日長で7日間維持します。この後、初期の2齢幼虫を人工食に移します。 移植時に、幼虫のバッチを飼料タイプと交絡させないように、特定の植物からの幼虫を4つの食事タイプに均等に分割します。幼虫(N = 合計346)を118 mLダイエットカップあたり2個体として移して、過密による病気の発生を減らし、成虫が最終的に閉じるための十分なスペースを確保します。 飼育カップの蓋にパンチ穴(蓋ごとに3つ)。カップを靴箱サイズのプラスチック製のゴミ箱に入れて飼育し、飼育室内の場所の体系的な影響を避けるために、さまざまな食事を散在させます。 幼虫のカップを14:10日長の23°Cの気候チャンバーに収容します(チャンバーの底に水の入ったビンがあり、湿度を約50%〜60%に保ち、家庭用湿度センサーで監視します)。カップがカビが生えた場合(このケーススタディでは合計約8カップ)、チャンバーからカップを取り外し、それらの個人を実験から外します。 幼虫が蛹化して飼育カップに出現するのを待ちます(N = 合計162)。注:この研究の飼育条件では、採卵から成虫の出現までの発育時間は平均して約25〜30日(20〜40日の範囲、例えば25,28)でした。 蛹が成虫の出現に近づいたら、新しく閉じた個体がないか毎日カップをチェックし、乾燥した翼で成虫を取り除きます。後翅の成虫に、先端の細かい黒いシャーピーを使用して、対応する個体番号(幼虫の移動時に割り当てられる)でラベルを付けます。各個人の性別を決定し、その数と出現日とともにグラシン封筒に印を付けます。成虫の蝶をグラシンエンベロープに入れ、さらに処理されるまで-20°Cで保管します。注:新興成人のごく一部は、飛行と成人の生存を妨げる翼の変形を示しています(5%-8%)。これらの個人は、これらの実験の生存分析から除外されます。 測定とデータ分析生存率を、2齢(毛虫が餌にされたとき)から成虫の出現までの生存率として測定します。注:本研究は、さまざまな食事のパフォーマンスの尺度として生存期間と発達時間に焦点を当てました。 発育時間を、食事への移行から気候室での成虫の出現までの日数として測定します。 データ分析のために、金属と濃度の間の相互作用を含む2つのモデルセットを実行します。注:両方の相互作用が有意であったため(F2,194 = 4.56、 開発 時間についてはp = 0.01、生存時間はX2 = 12.1、 p = 0.002)、研究は各金属の個別の分析を進めました。 生存率を分析するには、各金属のカイ二乗検定を実行して、翼が完全に無傷の成人期までの生存率に対する金属線量(4つのカテゴリーとして扱われる)の影響を検定します。 用量の有意な効果が検出されたら、フォローアップカイ二乗を実行して、各レベルを対照食と比較します。.発達時間(転移時から成虫としての出現時まで)を分析するために、発達時間に対する性別の影響をテストします。注:この実験では、どの金属についても、開発時間に対する性別の影響はなかったため(p > 0.10)、モデルでの考慮から除外しました。 金属ごとに個別のANOVAを実行して、開発時間に対する4つの濃度の影響をテストします。さらに、対照に対する各濃度のt検定を実行して、性能効果が見られる最小濃度を決定します。注:この研究では、すべての分析にJMP v16を使用しました。すべての生データはMendeley61で入手できます。