ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में ओ2 खपत को मापना कोलोमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमेट्री का उपयोग करके
Summary
छोटे जीवों की चयापचय दर को मापने के लिए कोलोमेट्रिक श्वासरोमिति आदर्श है। जब वर्तमान अध्ययन में ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए अनुकूलित किया गया, तो मापा गया ओ2 खपत पिछले अध्ययनों द्वारा वाइल्डटाइप डी मेलानोगास्टर के लिए रिपोर्ट की गई सीमा के भीतर थी। कास्क उत्परिवर्ती द्वारा प्रति-फ्लाई ओ2 खपत, जो छोटे और कम सक्रिय हैं, वाइल्डटाइप की तुलना में काफी कम थे।
Abstract
एक स्थिर वातावरण को बनाए रखते हुए छोटे जीवों की ओ2 खपत को मापने के लिए कोलोमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमेट्री एक सीधी, सस्ती विधि है। एक कूलमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर में एक एयरटाइट कक्ष होता है जिसमें ओ 2 का सेवन किया जाता है और जीव द्वारा उत्पादित सीओ2 को एक शोषक माध्यम द्वारा हटा दिया जाता है। परिणामी दबाव में कमी इलेक्ट्रोलाइटिक ओ 2 उत्पादन को ट्रिगर करती है, और उत्पादित ओ2 की मात्रा को इसे उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चार्ज की मात्रा को रिकॉर्ड करके मापा जाता है। वर्तमान अध्ययन में, विधि को छोटे समूहों में परीक्षण किए गए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें तंत्र की संवेदनशीलता और उच्च स्थिरता के लिए अनुकूलित पर्यावरणीय स्थितियां हैं। इस उपकरण में वाइल्डटाइप मक्खियों द्वारा खपत ओ2 की मात्रा पिछले अध्ययनों द्वारा मापी गई मात्रा के अनुरूप है। कास्क उत्परिवर्ती द्वारा द्रव्यमान-विशिष्ट ओ2 खपत, जो छोटे हैं और कम सक्रिय होने के लिए जाने जाते हैं, कॉन्जेनिक नियंत्रण से अलग नहीं थे। हालांकि, सीएएस्क उत्परिवर्ती के छोटे आकार के परिणामस्वरूप प्रति-फ्लाई आधार पर ओ2 खपत में उल्लेखनीय कमी आई। मेलानोगास्टर में ओ2 खपत को मापने में सक्षम माइक्रोरेस्पिरोमीटर है, जीनोटाइप के बीच मामूली अंतर को अलग कर सकता है, और चयापचय दर को मापने के लिए एक बहुमुखी उपकरण जोड़ता है।
Introduction
चयापचय दर को मापने की क्षमता अपने पर्यावरणीय संदर्भ में एक जीव की पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, जीवनकाल1 में इसकी भूमिका, चयापचय2 में आहार की भूमिका, या हाइपोक्सिक तनाव3 के लिए दहलीज को समझने के लिए चयापचय दर को मापना आवश्यक है।
चयापचय दरको मापने के लिए दो सामान्य दृष्टिकोण हैं। प्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री गर्मी उत्पादन को मापकर सीधे ऊर्जा व्यय को मापता है। अप्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री अन्य साधनों के माध्यम से ऊर्जा उत्पादन को मापता है, अक्सर ओ 2 खपत (वीओ 2), सीओ2 उत्पादन या दोनों के श्वसनमीट्रिक माप के माध्यम से। यद्यपि ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर5 सहित छोटे एक्टोथर्म पर प्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री लागू की गई है, श्वसनमिति तकनीकी रूप से सरल और अधिक सामान्य रूप से उपयोग की जाती है।
मेलानोगास्टर में चयापचय दर को मापने के लिए श्वसन के कई रूपों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है और तापमान6, सामाजिक वातावरण 3, आहार3,7, और न्यूरोडेवलपमेंटलविकारों 8 के चयापचय प्रभावों में अंतर्दृष्टि प्रदान की है। ये दो वर्गों में आते हैं, जो लागत और जटिलता में काफी भिन्न होते हैं। मैनोमेट्री सबसे सरल और कम से कम महंगा 9,10 है, जिसमें मक्खियों को एक सील कक्ष में रखा जाता है जिसमें सीओ 2 शोषक होता है और जो एक पतली केशिका के माध्यम से एक द्रव जलाशय से जुड़ा होता है। चूंकि ओ 2 का सेवन किया जाता है और सीओ2 अवशोषित होता है, कक्ष में दबाव कम हो जाता है और केशिका में तरल पदार्थ खींचा जाता है। केशिका का द्रव से भरा आयतन इसलिए वीओ 2 के आनुपातिक है। अधिक विस्तृत संस्करण, जो केशिका में तरल पदार्थ द्वारा लगाए गए बल की भरपाई करते हैं, का उपयोग डी मेलानोगास्टर1 पर भी किया गया है। मैनोमेट्री में सरल और सस्ती होने के फायदे हैं, लेकिन, क्योंकि यह दबाव के प्रति संवेदनशील है, निरंतर पर्यावरणीय परिस्थितियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, क्योंकि खपत ओ 2 को प्रतिस्थापित नहीं किया जाता है, ओ 2 (पी ओ 2) का आंशिक दबाव धीरे-धीरे कक्षों के अंदर कम हो जाता है।
गैस विश्लेषण का उपयोग करके श्वसनमिति का उपयोग नियमित रूप से डी मेलानोगास्टर के लिए भी किया जाता है। इस मामले में, मक्खियों वाले सील कक्षों से नियमित अंतराल पर गैसों का नमूना लिया जाता है और इन्फ्रारेड विश्लेषक 2,6,11 को भेजा जाता है। इस प्रकार के उपकरण के फायदे हैं कि यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, पर्यावरणीय परिस्थितियों के प्रति कम संवेदनशील है, और नमूने के दौरान गैसों को ताज़ा किया जाता है ताकि पीओ 2 स्थिर रहे। हालांकि, उपकरण संचालित करने के लिए महंगा और जटिल हो सकता है।
हाल ही में विकसित एक कूलमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर12 मौजूदा प्रणालियों के लिए एक सस्ता, संवेदनशील और स्थिर विकल्प प्रदान करता है। व्यवहार में, एक जीव को एक एयरटाइट कक्ष में रखा जाता है जहां वह ओ 2 का उपभोग करता है और उत्सर्जित सीओ2 को एक शोषक सामग्री द्वारा हटा दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कक्ष दबाव में शुद्ध कमी होती है। जब आंतरिक दबाव पूर्व-निर्धारित सीमा (ओएन-थ्रेशोल्ड) तक कम हो जाता है, तो विद्युत प्रवाह को इलेक्ट्रोलाइटिक ओ2 जनरेटर के माध्यम से पारित किया जाता है, जिससे इलेक्ट्रोलिसिस को रोकने वाली दूसरी सीमा (ऑफ-थ्रेशोल्ड) पर दबाव वापस आ जाता है। ओ 2 जनरेटर में चार्ज ट्रांसफर सीधे कक्ष को फिर से दबाव डालने के लिए आवश्यक ओ 2 की मात्रा के समानुपाती होता है और इसलिए इसका उपयोग जीव4 द्वारा खपत ओ 2 को मापने के लिए किया जा सकता है। विधि अत्यधिक संवेदनशील है, वी ओ 2 को सटीक रूप से मापता है, और ओ 2 का नियमित प्रतिस्थापन घंटों या दिनों के लिए लगभग स्थिर स्तर पर पीओ 2 को बनाए रख सकता है।
इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला कोलोमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर एक बहु-मोडल (दबाव, तापमान और आर्द्रता) इलेक्ट्रॉनिक सेंसर को नियोजित करता है। सेंसर एक माइक्रोकंट्रोलर द्वारा संचालित होता है जो दबाव में छोटे बदलावों का पता लगाता है और कम दबाव सीमा12 तक पहुंचने पर ओ2 पीढ़ी को सक्रिय करता है। इस उपकरण को शेल्फ भागों से इकट्ठा किया जाता है, इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के कक्षों और प्रयोगात्मक वातावरण के साथ किया जा सकता है, और बीटल टेनेब्रियो मोलिटर पर शरीर द्रव्यमान और तापमान के प्रभावों की जांच करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। वर्तमान अध्ययन में, माइक्रोरेस्पिरोमीटर को डी मेलानोगास्टर में ओ2 खपत को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें टी मोलिटर के द्रव्यमान का लगभग 1% है। ओ2 पीढ़ी को सक्रिय करने के लिए सीमा को कम करके उपकरण की संवेदनशीलता में वृद्धि की गई है, और तापमान-नियंत्रित जल स्नान में प्रयोगों का संचालन करके और 100% या उसके आसपास कक्षों के अंदर आर्द्रता बनाए रखकर पर्यावरणीय स्थिरता को बढ़ाया गया है।
सीएएस्क (कैलमोडुलिन-निर्भर सेरीन प्रोटीन काइनेज) प्रोटीन, झिल्ली से जुड़े गुआनिलेट किनेसेस (एमएजीयूके) के परिवार का हिस्सा है, जो विभिन्न बहु-प्रोटीन परिसरों में एक आणविक मचान है, और सीएएस्क में उत्परिवर्तन मनुष्यों में न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों से जुड़े हैं। मेलानोगास्टर उत्परिवर्ती, सीएएके18, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 15 की गतिविधि को बाधित करता है और कॉन्जेनिक नियंत्रण14,16 की तुलना में गतिविधि के स्तर को 50% से अधिक कम कर देता है। सीएएस्क उत्परिवर्ती की कम गतिविधि के स्तर और चयापचय को विनियमित करने में कैटेकोलामाइन की भूमिका के कारणहमने अनुमान लगाया कि उनकी मानक चयापचय दर, और इसलिए ओ2 खपत, नियंत्रण की तुलना में नाटकीय रूप से कम हो जाएगी।
O2 की खपत को CASK18 और उनके वाइल्डटाइप कंजेनर्स, w(ex33) में मापा गया था। मक्खियों के समूहों को श्वास-कक्षों में रखा गया था, ओ 2 खपत को मापा गया था, ओ2 खपत की गणना की गई थी और द्रव्यमान-विशिष्ट और प्रति-फ्लाई आधार दोनों पर व्यक्त किया गया था। उपकरण ने वाइल्डटाइप मक्खियों में वी ओ 2 दर्ज किया जो पिछले अध्ययनों के अनुरूप था, और यह वाइल्डटाइप और सीएएस्क उत्परिवर्ती मक्खियों की प्रति-फ्लाईओ 2 खपत के बीच अंतर कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
उपरोक्त प्रक्रिया एक इलेक्ट्रॉनिक कूलमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर का उपयोग करके डी मेलानोगास्टर में ओ2 खपत के माप को प्रदर्शित करती है। जंगली प्रकार के डी मेलानोगास्टर में ओ2 खपत के ल?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कैस्क उत्परिवर्ती की ओ2 खपत का परीक्षण करने और सीएएस्क उत्परिवर्ती और उनके कॉन्जेनिक नियंत्रण भेजने के लिए एरिज़ोना विश्वविद्यालय में डॉ लिंडा रेस्टिफो को धन्यवाद देते हैं। प्रकाशन शुल्क कॉलेज पार्क विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विभाग से विभागीय पुनर्निवेश निधि द्वारा प्रदान किया गया था। शैडी ग्रोव में विश्वविद्यालयों द्वारा स्थान और कुछ उपकरण प्रदान किए गए थे।
Materials
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
Referenzen
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. . Measuring Metabolic Rates. , (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetik. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J. Permeation of gases through solids. Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
