Het vermogen om de stofwisseling te meten is cruciaal voor een volledig begrip van een organisme in zijn omgevingscontext. Het is bijvoorbeeld noodzakelijk om de stofwisseling te meten om de rol ervan in levensduur¹, de rol van voeding in het metabolisme² of de drempel voor hypoxische stress³ te begrijpen.

Er zijn twee algemene benaderingen voor het meten van de stofwisseling⁴. Directe calorimetrie meet het energieverbruik rechtstreeks door de warmteproductie te meten. Indirecte calorimetrie meet de energieproductie op andere manieren, vaak via respirometrische meting van het O2-verbruik (V_O2), de CO₂ -productie of beide. Hoewel directe calorimetrie is toegepast op kleine ectothermen, waaronder Drosophila melanogaster⁵, is respirometrie technisch eenvoudiger en wordt het vaker gebruikt.

Verschillende vormen van respirometrie zijn met succes gebruikt om de stofwisseling te meten bij wildtype en mutant D. melanogaster en hebben inzicht gegeven in de metabole effecten van temperatuur⁶, sociale omgeving 3, voeding ^{3,7 en} neurologische ontwikkelingsstoornissen⁸. Deze vallen uiteen in twee klassen, die aanzienlijk variëren in kosten en complexiteit. Manometrie is de eenvoudigste en goedkoopste^9,10, waarbij vliegen in een afgesloten kamer worden geplaatst die een CO₂ -absorberend middel bevat en die via een dun capillair is verbonden met een vloeistofreservoir. Naarmate O 2 wordt verbruikt en CO₂ wordt geabsorbeerd, neemt de druk in de kamer af en wordt vloeistof in het capillair gezogen. Het met vloeistof gevulde volume van het capillair is daarom evenredig met V_O2. Meer uitgebreide versies, die de kracht compenseren die door de vloeistof in het capillair wordt uitgeoefend, zijn ook gebruikt op D. melanogaster¹. Manometrie heeft het voordeel dat het eenvoudig en goedkoop is, maar omdat het gevoelig is voor druk, vereist het constante omgevingsomstandigheden. Verder, omdat verbruikt O 2 niet wordt vervangen, neemt de partiële druk van O₂ (P_O2) geleidelijk af in de kamers.

Respirometrie met behulp van gasanalyse wordt ook regelmatig gebruikt voor D. melanogaster. In dit geval worden met regelmatige tussenpozen gassen bemonsterd uit afgesloten kamers met vliegen en naar een infraroodanalysator 2,6,11 gestuurd. Dit type apparaat heeft als voordeel dat het in de handel verkrijgbaar is, minder gevoelig is voor omgevingsomstandigheden en dat gassen tijdens de bemonstering worden ververst, zodat P_O2 stabiel blijft. De apparatuur kan echter duur en complex zijn om te bedienen.

Een recent ontwikkelde coulometrische microrespirometer¹² biedt een goedkoop, gevoelig en stabiel alternatief voor bestaande systemen. In de praktijk wordt een organisme in een luchtdichte kamer geplaatst waar het O 2 verbruikt en de uitgeademde CO₂ wordt verwijderd door een absorberend materiaal, wat resulteert in een netto afname van de kamerdruk. Wanneer de interne druk daalt tot een vooraf ingestelde drempel (AAN-drempel), wordt stroom door een elektrolytische O_2-generator geleid, waardoor de druk wordt teruggevoerd naar een tweede drempel (UIT-drempel), waardoor de elektrolyse wordt gestopt. De ladingsoverdracht over de O 2-generator is recht evenredig met de hoeveelheid O 2 die nodig is om de kamer opnieuw onder druk te brengen en kan daarom worden gebruikt om de O₂ te meten die door het organisme wordt verbruikt⁴. De methode is zeer gevoelig, meet V O2 nauwkeurig en de regelmatige vervanging van O₂ kan P_O2 uren of dagen op een bijna constant niveau houden.

De coulometrische microrespirometer die in dit onderzoek wordt gebruikt, maakt gebruik van een multimodale (druk, temperatuur en vochtigheid) elektronische sensor. De sensor wordt bediend door een microcontroller die kleine drukveranderingen detecteert en O_2-generatie activeert wanneer een lagedrukdrempel¹² wordt bereikt. Dit apparaat is samengesteld uit kant-en-klare onderdelen, kan worden gebruikt met een breed scala aan kamers en experimentele omgevingen, en is met succes gebruikt om de effecten van lichaamsgewicht en temperatuur op de kever Tenebrio molitor te onderzoeken. In de huidige studie is de microrespirometer aangepast om het_O2-verbruik te meten in D. melanogaster, dat ongeveer 1% van de massa van T. molitor heeft. De gevoeligheid van het apparaat is verhoogd door de drempel voor het activeren van O_2-opwekking te verlagen, en de stabiliteit van het milieu is verbeterd door experimenten uit te voeren in een temperatuurgecontroleerd waterbad en door de luchtvochtigheid in de kamers op of in de buurt van 100% te houden.

Het CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) eiwit, onderdeel van de familie van membraan-geassocieerde guanylaatkinasen (MAGUK), is een moleculair steiger in verschillende multi-eiwitcomplexen, en mutaties in CASK zijn geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen bij mensen en bij D. melanogaster^13,14. Een levensvatbare D. melanogaster-mutant, CASK^Δ18, verstoort de activiteit van dopaminerge neuronen 15 en vermindert de activiteitsniveaus met meer dan 50% in vergelijking met congene controles^14,16. Vanwege de verminderde activiteitsniveaus van CASK mutanten en de rol van catecholamines bij het reguleren van het metabolisme¹⁷ veronderstelden we dat hun standaard stofwisseling, en dus O₂ consumptie, drastisch zou worden verminderd in vergelijking met controles.

O₂ consumptie werd gemeten in CASK^Δ18 en hun wildtype congeneren, w(ex33). Groepen vliegen werden in respirometriekamers geplaatst, het O 2-verbruik werd gemeten, het O_2-verbruik werd berekend en uitgedrukt op zowel massaspecifieke basis als per vlieg. Het apparaat registreerde V_O2 in wildtype vliegen, wat consistent was met eerdere studies, en het kon onderscheid maken tussen de O_2-consumptie per vlieg van wildtype en CASK mutante vliegen.