قياس استهلاك O2 في ذبابة الفاكهة الميلانية باستخدام قياس التنفس المجهري بقياس الكولوم
Summary
قياس التنفس بقياس الكولوم مثالي لقياس معدل الأيض للكائنات الحية الدقيقة. عند تكييفه مع ذبابة الفاكهة الميلانية في الدراسة الحالية ، كان استهلاك O2 المقاس ضمن النطاق الذي تم الإبلاغ عنه للنوع البري D. melanogaster من خلال الدراسات السابقة. كان استهلاك O2 لكل ذبابة بواسطة طفرات CASK ، وهي أصغر حجما وأقل نشاطا ، أقل بكثير من النوع البري.
Abstract
قياس التنفس الدقيق للكولوم هو طريقة مباشرة وغير مكلفة لقياس استهلاك O2 للكائنات الحية الصغيرة مع الحفاظ على بيئة مستقرة. يتكون مقياس التنفس المجهري الكولوم من غرفة محكمة الإغلاق يتم فيها استهلاك O 2 ويتم إزالة CO2 الذي ينتجه الكائن الحي بواسطة وسيط ماص. يؤدي انخفاض الضغط الناتج إلى إنتاج O 2 كهربائيا ، ويتم قياس كمية O2 المنتجة عن طريق تسجيل كمية الشحنة المستخدمة لتوليدها. في هذه الدراسة ، تم تكييف الطريقة مع ذبابة الفاكهة الميلانية التي تم اختبارها في مجموعات صغيرة ، مع حساسية الجهاز والظروف البيئية المحسنة لتحقيق ثبات عالي. تتوافق كمية O2 التي يستهلكها الذباب البري في هذا الجهاز مع تلك التي تم قياسها بواسطة الدراسات السابقة. لم يكن استهلاك O2 الخاص بالكتلة بواسطة طفرات CASK ، وهي أصغر ومعروفة بأنها أقل نشاطا ، مختلفا عن الضوابط المتجانسة. ومع ذلك ، أدى صغر حجم طفرات CASK إلى انخفاض كبير في استهلاك O2 على أساس كل ذبابة. لذلك ، فإن مقياس التنفس الدقيق قادر على قياس استهلاك O2 في D. melanogaster ، ويمكنه التمييز بين الاختلافات المتواضعة بين الأنماط الجينية ، ويضيف أداة متعددة الاستخدامات لقياس معدلات الأيض.
Introduction
القدرة على قياس معدل الأيض أمر بالغ الأهمية لفهم كامل للكائن الحي في سياقه البيئي. على سبيل المثال ، من الضروري قياس معدل الأيض من أجل فهم دوره في العمر1 ، أو دور النظام الغذائي في التمثيل الغذائي2 ، أو عتبة الإجهاد نقص الأكسجين3.
هناك طريقتان عامتان لقياس معدل الأيض4. يقيس القياس الحراري المباشر إنفاق الطاقة مباشرة عن طريق قياس إنتاج الحرارة. يقيس القياس الحراري غير المباشر إنتاج الطاقة من خلال وسائل أخرى ، غالبا عن طريق القياس التنفسي لاستهلاك O2 (VO2) أو إنتاج CO2 أو كليهما. على الرغم من تطبيق القياس الحراري المباشر على الحرارة الخارجية الصغيرة ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر5 ، إلا أن قياس التنفس أبسط تقنيا وأكثر استخداما.
تم استخدام عدة أشكال من قياس التنفس بنجاح لقياس معدل الأيض في النوع البري والمتحولة D. melanogaster وقدمت نظرة ثاقبة للتأثيرات الأيضية لدرجة الحرارة6 ، والبيئة الاجتماعية 3 ، والنظام الغذائي3،7 ، واضطرابات النمو العصبي8. تنقسم هذه إلى فئتين ، والتي تختلف اختلافا كبيرا في التكلفة والتعقيد. قياس الضغط هو أبسط وأقل تكلفة 9,10 ، حيث يتم وضع الذباب في غرفة مغلقة تحتوي على مادة ماصة CO2 والتي ترتبط عبر شعرية رقيقة بخزان السوائل. عندما يتم استهلاك O2 وامتصاص CO2 ، ينخفض الضغط في الغرفة ويتم سحب السائل إلى الشعيرات الدموية. ومن ثم، فإن حجم الشعيرات الدموية المملوء بالسائل يتناسب مع VO2. كما تم استخدام إصدارات أكثر تفصيلا ، والتي تعوض عن القوة التي يمارسها السائل في الشعيرات الدموية ، على D. melanogaster1. يتميز قياس الضغط بكونه بسيطا وغير مكلف ، ولكن لأنه حساس للضغط ، يتطلب ظروفا بيئية ثابتة. علاوة على ذلك ، نظرا لعدم استبدال O2 المستهلك ، فإن الضغط الجزئي ل O2 (PO2) ينخفض تدريجيا داخل الغرف.
كما يستخدم قياس التنفس باستخدام تحليل الغاز بانتظام ل D. melanogaster. في هذه الحالة ، يتم أخذ عينات من الغازات على فترات منتظمة من غرف محكمة الغلق تحتوي على الذباب وإرسالها إلى محلل الأشعة تحت الحمراء2،6،11. يتميز هذا النوع من الأجهزة بمزايا أنه متاح تجاريا ، وهو أقل حساسية للظروف البيئية ، ويتم تحديث الغازات أثناء أخذ العينات بحيث يظل PO2 مستقرا. ومع ذلك ، يمكن أن تكون المعدات باهظة الثمن ومعقدة للعمل.
يوفر مقياس التنفس المجهري12 الكولومتري الذي تم تطويره مؤخرا بديلا غير مكلف وحساس ومستقر للأنظمة الحالية. في الممارسة العملية ، يتم وضع الكائن الحي في غرفة محكمة الإغلاق حيث يستهلك O2 ويتم إزالة ثاني أكسيد الكربون الزفير2 بواسطة مادة ماصة ، مما يؤدي إلى انخفاض صاف في ضغط الغرفة. عندما ينخفض الضغط الداخلي إلى عتبة محددة مسبقا (ON-bit) ، يتم تمرير التيار عبر مولد O2 كهربائيا ، مما يعيد الضغط إلى عتبة ثانية (عتبة OFF) توقف التحليل الكهربائي. يتناسب نقل الشحنة عبر مولد O 2 طرديا مع كمية O 2 المطلوبة لإعادة ضغط الغرفة وبالتالي يمكن استخدامه لقياس O2 الذي يستهلكه الكائن الحي4. الطريقة حساسة للغاية ، وتقيس V O2 بدقة ، ويمكن للاستبدال المنتظم ل O2 الحفاظ على PO2 عند مستوى ثابت تقريبا لساعات أو أيام.
يستخدم مقياس التنفس المجهري الكولوم المستخدم في هذه الدراسة مستشعرا إلكترونيا متعدد الوسائط (الضغط ودرجة الحرارة والرطوبة). يتم تشغيل المستشعر بواسطة متحكم دقيق يكتشف التغيرات الصغيرة في الضغط وينشط جيل O2 عند الوصول إلى عتبة الضغط المنخفض12. يتم تجميع هذا الجهاز من خارج أجزاء الرف ، ويمكن استخدامه مع مجموعة متنوعة من الغرف والبيئات التجريبية ، وقد تم استخدامه بنجاح لفحص تأثيرات كتلة الجسم ودرجة الحرارة على خنفساء Tenebrio molitor. في الدراسة الحالية ، تم تكييف مقياس التنفس الدقيق لقياس استهلاك O2 في D. melanogaster ، الذي يحتوي على ما يقرب من 1 ٪ من كتلة T. molitor. تمت زيادة حساسية الجهاز عن طريق تقليل عتبة تنشيط جيلO 2 ، وتم تعزيز الاستقرار البيئي من خلال إجراء تجارب في حمام مائي يتم التحكم في درجة حرارته والحفاظ على الرطوبة داخل الغرف عند أو بالقرب من 100٪.
بروتين CASK (بروتين سيرين كيناز المعتمد على الكالمودولين) ، وهو جزء من عائلة كينازات غوانيلات المرتبطة بالغشاء (MAGUK) ، هو سقالة جزيئية في مجمعات متعددة البروتينات مختلفة ، وترتبط الطفرات في CASK باضطرابات النمو العصبي لدى البشر وفي D. melanogaster13,14. متحولة D. melanogaster قابلة للحياة ، CASKΔ18 ، تعطل نشاط الخلايا العصبية الدوبامينية 15 وتقلل من مستويات النشاط بأكثر من 50٪ مقارنة بالضوابط الخلقية14,16. بسبب انخفاض مستويات نشاط طفرات CASK ودور الكاتيكولامينات في تنظيم عملية التمثيل الغذائي17 افترضنا أن معدل الأيض القياسي ، وبالتالي استهلاك O2 ، سينخفض بشكل كبير مقارنة بالضوابط.
تم قياس استهلاك O2 في CASKΔ18 ومتجانساتها البرية ، w (ex33). تم وضع مجموعات من الذباب في غرف قياس التنفس ، وتم قياس استهلاك O 2 ، وتم حساب استهلاك O2 والتعبير عنه على أساس الكتلة الخاصة ولكل ذبابة. سجل الجهاز VO2 في الذباب البري الذي كان متسقا مع الدراسات السابقة ، ويمكن أن يفرق بين استهلاك O2 لكل ذبابة من النوع البري والذباب الطافر CASK.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح الإجراء أعلاه قياس استهلاك O2 في D. Melanogaster باستخدام مقياس التنفس المجهري الكولومتري الإلكتروني. كانت البيانات الناتجة عن استهلاك O2 في D. melanogaster من النوع البري ضمن النطاقات الموصوفة في معظم المنشورات السابقة باستخدام طرق متنوعة (الجدول 1) على الرغم من أنها …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة ليندا ريستيفو في جامعة أريزونا على اقتراحها اختبار استهلاك O2 من طفرات CASK ولإرسال طفرات CASK وضوابطها الملائمة. تم توفير رسوم النشر من قبل صندوق إعادة الاستثمار الإداري من قسم الأحياء في جامعة كوليدج بارك. تم توفير المساحة وبعض المعدات من قبل الجامعات في Shady Grove.
Materials
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
Referenzen
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. . Measuring Metabolic Rates. , (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetik. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J. Permeation of gases through solids. Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
