JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Generatie en manipulatie van darmorganoïden van ratten

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65343
, , ,
1Department of Genetics,Yale School of Medicine, 2Department of Pediatrics,Yale School of Medicine, 3Department of Pediatrics/Gastroenterology and Hepatology,Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology,Yale School of Medicine, 5Yale Stem Cell Center,Yale School of Medicine, 6Yale Cancer Center,Yale School of Medicine

Summary

Hier presenteren we een protocol om darmorganoïden van ratten te genereren en deze te gebruiken in verschillende stroomafwaartse toepassingen. Ratten zijn vaak een geprefereerd preklinisch model, en het robuuste intestinale organoïdesysteem voorziet in de behoefte aan een in vitro systeem om in vivo studies te begeleiden.

Abstract

Bij het gebruik van organoïden om fysiologie en beslissingen over het lot van cellen te beoordelen, is het belangrijk om een model te gebruiken dat in vivo contexten nauwkeurig recapituleert. Dienovereenkomstig worden van patiënten afgeleide organoïden gebruikt voor ziektemodellering, het ontdekken van geneesmiddelen en gepersonaliseerde behandelingsscreening. Darmorganoïden van muizen worden vaak gebruikt om aspecten van zowel de darmfunctie/fysiologie als de stamceldynamiek/lotsbeslissingen te begrijpen. In veel ziektecontexten hebben ratten echter vaak de voorkeur boven muizen als model vanwege hun grotere fysiologische gelijkenis met mensen in termen van ziektepathofysiologie. Het rattenmodel is beperkt door een gebrek aan genetische hulpmiddelen die in vivo beschikbaar zijn, en darmorganoïden van ratten zijn kwetsbaar gebleken en moeilijk te kweken op de lange termijn. Hier bouwen we voort op eerder gepubliceerde protocollen om op robuuste wijze darmorganoïden van ratten te genereren uit de twaalfvingerige darm en het jejunum. We geven een overzicht van verschillende stroomafwaartse toepassingen waarbij gebruik wordt gemaakt van darmorganoïden van ratten, waaronder functionele zwellingstesten, kleuring van de hele mont, het genereren van 2D-enteroïde monolagen en lentivirale transductie. Het organoïdemodel van de rat biedt een praktische oplossing voor de behoefte van het veld aan een in vitro model dat fysiologisch relevant blijft voor de mens, snel genetisch kan worden gemanipuleerd en gemakkelijk kan worden verkregen zonder de barrières die gepaard gaan met het verkrijgen van menselijke darmorganoïden.

Introduction

De epitheelarchitectuur en cellulaire samenstelling van de mens in de dunne darm zijn complex en weerspiegelen hun fysiologische functies. De primaire rol van de dunne darm is het absorberen van voedingsstoffen uit voedsel dat door het lumengaat 1. Om deze functie te maximaliseren, is het darmoppervlak georganiseerd in vingerachtige uitsteeksels, villi genaamd, die het absorptieoppervlak vergroten, en bekerachtige invaginaties, crypten genaamd, die de stamcellen huisvesten en isoleren. Binnen het epitheel worden verschillende gespecialiseerde absorberende en secretoire celtypen gegenereerd om verschillende functies uit te voeren1. Vanwege deze complexiteit was het moeilijk om weefsels zoals de darm te modelleren in hoogovergangsgetransformeerde onsterfelijke cellijnen. De studie van stamcellen, met name volwassen stamcellen en hun differentiatiemechanismen, heeft echter de ontwikkeling van 3D-darmorganoïdeculturen mogelijk gemaakt. Het gebruik van organoïdemodellen heeft het veld getransformeerd, deels vanwege hun recapitulatie van enkele architecturale componenten en heterogeniteit van celtypen die in de intacte darm worden aangetroffen. Intestinale organoïden kunnen langdurig in vitro worden gekweekt door het behoud van de actieve stamcelpopulatie2.

Intestinale organoïden zijn snel een aanpasbaar model geworden om stamcelbiologie, celfysiologie, genetische ziekten en voeding te bestuderen3,4, evenals een hulpmiddel om nieuwe methoden voor medicijnafgifte te ontwikkelen5. Daarnaast worden van patiënten afgeleide organoïden gebruikt voor onder andere ziektemodellering, het ontdekken van geneesmiddelen en gepersonaliseerde behandelingsscreening 6,7,8,9. Menselijke darmorganoïden vormen echter nog steeds uitdagingen. Beschikbaarheid van weefsels, vereisten voor goedkeuring door de Institutional Review Board en ethische kwesties beperken het wijdverbreide gebruik van menselijke monsters. Bovendien vereisen menselijke darmorganoïden die worden gegenereerd uit darmcrypten twee verschillende kweekomstandigheden voor het behoud van ongedifferentieerde stamcellen of om de differentiatie van rijpe celtypen te induceren10. Dit in tegenstelling tot in vivo, waar stamcellen en rijpe gedifferentieerde celtypen tegelijkertijd aanwezig zijn en continu worden gegenereerd/onderhouden1. Aan de andere kant hebben darmorganoïden van muizen, die worden gekweekt in een minder complexe cocktail van groeifactoren, deze omschakeling in mediasamenstelling niet nodig en kunnen ze stamcellen en gedifferentieerde cellen in dezelfde mediacontext behouden 2,11. Belangrijke verschillen in de darm van muizen in vergelijking met mensen kunnen muizenorganoïden echter in veel gevallen tot een suboptimaal model maken. Over het algemeen zijn veel darmorganoïden van grotere zoogdieren, waaronder paarden, varkens, schapen, koeien, honden en katten, met succes gegenereerd in kweekomstandigheden die nauwer aansluiten bij darmorganoïden van muizen dan de kweekomstandigheden van menselijke darmorganoïden12. De verschillen in groeifactorcondities tussen muizen en menselijke organoïden weerspiegelen waarschijnlijk verschillen in de samenstelling van stamcelniches en verschillende vereisten voor overleving, proliferatie en onderhoud van stamcellen. Daarom is er behoefte aan een gemakkelijk toegankelijk modelorganoïdesysteem dat 1) sterk lijkt op de samenstelling van menselijke darmcellen, 2) stamcellen bevat met groeifactorvereisten zoals die van menselijke darmorganoïden, en 3) in staat is om continu ongedifferentieerde en gedifferentieerde compartimenten in stand te houden. Idealiter zou het systeem gebaseerd zijn op een veelgebruikt preklinisch diermodel, zodat in-vivo- en in-vitro-experimenten kunnen worden gecorreleerd en samen kunnen worden gebruikt.

Ratten zijn een veelgebruikt preklinisch model voor darmfysiologie en farmacologiestudies vanwege hun zeer vergelijkbare darmfysiologie en biochemie als die van mensen13, met name met betrekking tot darmpermeabiliteit14. Door hun relatief grotere formaat in vergelijking met muizen zijn ze vatbaarder voor chirurgische ingrepen. Hoewel soms grote diermodellen, waaronder varkens, worden gebruikt, zijn ratten een betaalbaarder model, hebben ze minder ruimte nodig voor de veehouderij en hebben ze gemakkelijk in de handel verkrijgbarestandaardstammen15. Een nadeel van het gebruik van rattenmodellen is dat de genetische toolkit voor in vivo studies niet goed ontwikkeld is in vergelijking met muizen, en het genereren van nieuwe rattenlijnen, waaronder knock-outs, knock-ins en transgenen, is vaak onbetaalbaar. De ontwikkeling en optimalisatie van een robuust darmorganoïdemodel voor ratten zou genetische manipulatie, farmacologische behandelingen en studies met een hogere doorvoer mogelijk maken in een toegankelijk model dat de belangrijkste fysiologische relevantie voor mensen behoudt. De voordelen van het ene knaagdierorganoïdemodel ten opzichte van het andere zijn echter sterk afhankelijk van het specifieke proces of gen dat wordt bestudeerd; Bepaalde genen die bij mensen worden aangetroffen, kunnen pseudogenen zijn bij muizen, maar niet bij ratten16,17. Bovendien worden soortspecifieke celsubtypes steeds vaker onthuld door single-cell RNAseq18,19,20. Ten slotte vertonen modellen voor darmziekten bij ratten en muizen vaak aanzienlijke variaties in fenotypes21,22, zodat het model dat de symptomen en het ziekteproces bij mensen nauwkeuriger recapituleert, moet worden geselecteerd voor stroomafwaarts werk. Het genereren van een darmorganoïdemodel van ratten biedt onderzoekers extra flexibiliteit en keuze bij het selecteren van een modelsysteem dat het meest geschikt is voor hun omstandigheden. Hier worden bestaande protocollen23,24 uitgebreid voor het genereren van darmorganoïden van ratten en wordt een protocol geschetst voor het genereren en onderhouden van darmorganoïden van ratten uit de twaalfvingerige darm of jejunum. Daarnaast worden verschillende stroomafwaartse toepassingen beschreven, waaronder lentivirale infectie, kleuring van de hele berg en forskoline-zwellingstests.

Protocol

OPMERKING: Alle celkweek moet worden behandeld met behulp van de juiste aseptische techniek in een weefselkweekkap. Al het dierwerk in deze studie werd goedgekeurd door Yale’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Bereiding van reagentia voor celkweek Bereid R-spondin 1 geconditioneerde media voor volgens de instructies van de fabrikant. Bereid Wnt3a geconditioneerde media voor volgens de instructies van de fabrikant. Bereid AdDMEM+ voor zoals beschreven in Tabel 1. Resuspendeer gastrine in steriele dH2O om een bouillon van 100 μM te bereiden. Aliquot en bewaren bij -80 °C. Resuspendeer N-acetylcysteïne in steriel water om een voorraad van 100 mM te bereiden. Aliquot en maximaal 1 maand bewaren bij -20 °C. Resuspendeer recombinant humaan Noggin in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,1% runderserumalbumine (BSA) om een voorraad van 250 μg/ml te bereiden. Aliquot en bewaren bij -80 °C. Resuspendeer recombinante epidermale groeifactor (EGF) van muizen in PBS + 0,1% BSA om een voorraad van 100 μg/ml te bereiden. Aliquot en bewaren bij -80 °C. Verdun recombinant humaan IGF-1 in PBS + 0,1% BSA om een voorraad van 100 μg/ml te bereiden. Aliquot en bewaren bij -80 °C. Resuspendeer recombinant humaan FGF-2 in 5 mM Tris, pH 7,6, om een bouillon van 100 μg/ml te bereiden. Aliquot en bewaren bij -80 °C.OPMERKING: Gebruik voor alle groeifactoren een tussenverdunning in PBS + 0,1% BSA tot 100x de uiteindelijke concentratie in de kweekmedia. Bewaren bij -20 °C. 2. Oprichting van organoïden van de dunne darm van ratten OPMERKING: Dit protocol is aangepast ten opzichte van twee eerder gepubliceerde protocollen voor darmorganoïden van ratten23,24. Bereid de darmorganoïde media (rIOM) van ratten volgens tabel 2 en stel een waterbad in op 37 °C. Dit complete medium is 5 dagen stabiel bij 4 °C. Bereid 10 ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) van 3 ml in PBS in een conische buis van 15 ml en bewaar op ijs. Ontdooi 250 μL extracellulair matrixextract (EME) op ijs. Snel een rat ‘s nachts met toegang tot water ad libitum. Euthanaseer de rat volgens het door IACUC goedgekeurde protocol. In dit protocol werden volwassen mannelijke Sprague Dawley-ratten (met een gewicht van ~200 g) geëuthanaseerd via CO2 -inhalatie (Tabel met materialen). Cervicale dislocatie werd gebruikt als een secundaire methode van euthanasie. Gebruik een steriele autoclaveertang en een dissectieschaar voor dissectie. Plaats de geëuthanaseerde rat op het dissectieoppervlak met de ventrale zijde naar boven. Knijp met een tang in de huidlaag; De volgende sneden moeten aan de oppervlakte worden gemaakt, zodat ze alleen door deze huidlaag snijden en niet diep genoeg om inwendige organen te beschadigen. Om de buikholte te openen, snijdt u met een grote, scherpe dissectieschaar door de huidlaag in een grote, longitudinale snede op oppervlakteniveau in het midden van de buik. Maak vervolgens, voortkomend uit die snede, twee kortere horizontale sneden, één aan elke kant. Gebruik een tang om de huid weg te pellen om de buikholte bloot te leggen. Snijd door het peritoneale membraan om de inwendige organen in de buikholte volledig bloot te leggen met gemakkelijke toegang tot de darm. Lokaliseer met een schaar en een tang de maag en identificeer de twaalfvingerige darm ongeveer 2-3 cm distaal ervan, die eruitziet als een geelachtig segment. Het proximale jejunum bevindt zich ongeveer 4-5 cm distaal van het ligament van Treitz, dat dient als een oriëntatiepunt tussen de twaalfvingerige darm en het jejunum. Plaats het geïsoleerde darmfragment in een petrischaal van 10 cm. Reinig het gewenste darmsegment van mesenterium zoveel mogelijk. Spoel met 10 ml ijskoude PBS tot het luminale inhoud is ontdaan. Snijd het darmsegment op een papieren handdoek in stukken van ~2 cm lang. Open elk darmstukje in de lengterichting om het epitheel bloot te leggen. Schraap met een glazen microscoopglaasje het blootgestelde luminale oppervlak om villi te verwijderen. Plaats darmstukjes in de bereide EDTA-oplossing op ijs. Draai gedurende 30 minuten op 4 °C op een buisrevolver die is ingesteld op 10 tpm. Giet bij de ontleedmicroscoop de inhoud van de conische buis in een petrischaaltje van 10 cm. Voeg nog eens ~5 ml ijskoude PBS toe. Houd met een fijne pincet een darmsegment vast en schud krachtig. Het zal mogelijk zijn om het epitheel in de PBS te zien vrijkomen. In eerste instantie zal de PBS voornamelijk villi bevatten. Blijf schudden. Gooi de PBS-bevattende villi regelmatig weg en voeg 10 ml verse, ijskoude PBS toe aan de darmfragmenten. Ga door met het schudden van de fragmenten en herhaal deze wasstap totdat villi niet langer in de PBS worden vrijgegeven, maar in plaats daarvan bevat de PBS voornamelijk crypten. Overschrijd de 15 minuten voor crypte-isolatie, zodat de levensvatbaarheid van de cel niet in het gedrang komt. Gooi de resterende darmfragmenten weg. Verrijk de resterende PBS in de petrischaal voor darmcrypten. Verzamel in een weefselkweekkap de PBS-bevattende crypten en filtreer ze door een celzeef van 70 μm (Materiaaltabel). Centrifugeer op 250 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 5 ml AdDMEM+. Centrifugeer opnieuw op 250 x g gedurende 5 min.NOTITIE: Het wordt aanbevolen om een centrifuge met een zwenkbakrotor te gebruiken. Verwijder het supernatant en laat ~50 μL media achter bij de pellet. Resuspendeer de pellet in de resterende media en voeg toe aan de aliquot van de EME op ijs. Pipeteer voorzichtig op en neer om de crypten gelijkmatig door de EME te laten hangen. Vermijd het introduceren van bubbels. Plaats 50 μL EME-koepels in een weefselkweekschaal van 35 mm en incubeer gedurende 20 minuten in een weefselkweekincubator van 37 °C, 5% CO2 -weefsel. Voeg 2 ml rIOM toe (tabel 2) met 10 μM Y27632 en 10 μM CHIR99021 (tabel 3). Na het passeren kunnen Y27632 en CHIR99021 worden stopgezet. Verander de rIOM elke 2-3 dagen. Passage indien nodig, meestal tussen 3-7 dagen, afhankelijk van het aanvankelijke aantal organoïden, de grootte en de groeisnelheid. 3. Darmorganoïden van ratten passeren Ontdooi een aliquot van 250 μl EME op ijs en verwarm de rIOM voor op 37 °C. Zuig het medium op uit een plaat van 35 mm met organoïden en voeg 1 ml dissociatiereagens toe om de organoïden onmiddellijk uit de EME-koepels vrij te maken. Breng onmiddellijk dissociatiereagens met gefragmenteerde organoïden over in een conische buis van 15 ml. Was de kweekplaat met 2 ml AdDMEM+ en voeg toe aan de conische buis van 15 ml met gefragmenteerde organoïden. Pipetteer met een glazen pasteurpipet voorzichtig 15-20 keer op en neer om de organoïden te fragmenteren. Centrifugeer op 350 x g gedurende 2 min. Voeg ~50 μL oplossing van de bodem van de conische buis toe aan de EME. Pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen. Vermijd het maken van bubbels. Schep 50 μL EME-koepels in een schaal van 35 mm en incubeer gedurende 20 minuten in een 37 °C, 5% CO2 -weefselkweekincubator. Voeg 2 ml rIOM toe met 10 μM Y27632 en 10 μM CHIR99021. Vervang de groeimedia elke 2-3 dagen. Bij het wisselen van media kunnen Y27632 en CHIR99021 worden weggelaten. 4. Cryopreservatie en ontdooien van darmorganoïden van ratten Cryoconserverende darmorganoïden van rattenOPMERKING: Het cryopreservatieprotocol is gewijzigd ten opzichte van een eerder protocol voor organoïden van mensen en muizen25. Voorafgaand aan het invriezen moeten de organoïden ten minste twee passages in de primaire cultuur hebben. Het is raadzaam om organoïden te kweken tot het punt van grote sferoïden of licht ontluikende organoïden voorafgaand aan cryopreservatie, omdat dit zal resulteren in een hogere opbrengst van levensvatbare organoïden na ontdooiing. Dit kan worden bereikt door de met R-spondine geconditioneerde media te verhogen tot 15% en/of door 10 mM nicotinamide (tabel 3) toe te voegen aan de organoïdecultuur.Tel met een microscoop het aantal organoïden op de schaal van 35 mm. Label de cryovials zodanig dat er 200 organoïden in elke cryovial worden gealiquoteerd. Haal de rIOM uit de 35 mm schaal. Vervang door 2 ml PBS van koude weefselkweekkwaliteit. Gebruik een P1000-tip om de EME-koepels vanaf de bodem van de kweekschaal los te maken in de PBS door op en neer te pipetteren. Blijf ~20 keer op en neer pipetteren om de EME op te breken en de organoïden vrij te geven. Verzamel de organoïden en PBS in een conische buis van 15 ml. Voeg 2 ml koude PBS toe aan de kweekschaal en pipetteer op en neer om eventuele resterende organoïden in de PBS vrij te geven. Breng de PBS over naar de conische buis van 15 ml. Pelleteer de organoïden door ze gedurende 5 minuten te centrifugeren op 290 x g . Verwijder het supernatans en gooi het weg zonder de organoïdekorrel te verstoren. Was de pellet door deze voorzichtig te resuspenderen in 5 ml koude AdDMEM+. Centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg. Resuspendeer de organoïdekorrel in 1 ml koud vriesmedium per 200 organoïden. Aliquot 1 ml organoïden in vriesmedium per gelabeld cryoviaal. Plaats de cryovials in een vriescontainer. Bewaar de organoïden gedurende 24 uur in een vriescontainer bij -80 °C en breng de cryovials vervolgens over in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Darmorganoïden van ratten ontdooienOPMERKING: Dit protocol is aangepast ten opzichte van een eerder protocol voor het ontdooien van darmorganoïden van mensen en muizen26.Ontdooi een aliquot van 250 μl EME op ijs. Bereid rIOM aangevuld met 15% R-spondine geconditioneerde media, 10 μM Y27632 en 10 μM CHIR99021. Warm bij 37 °C. Voeg 2 ml ontdooimedium (tabel 3) toe aan een conische buis van 15 ml bij kamertemperatuur. Haal een injectieflacon met organoïden uit vloeibare stikstof en ontdooi deze door de injectieflacon in een waterbad van 37 °C te plaatsen totdat de injectieflacon bijna volledig is ontdooid. Voeg 1 ml ontdooimedium toe aan de injectieflacon en breng de volledige inhoud over in de conische buis met ontdooimedium. Was de injectieflacon twee keer met 1 ml ontdooimedium en breng over naar de conische buis. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min. Zuig het medium op en laat ~50 μL medium achter met de organoïden. Breng de media met organoïden over op 250 μL EME. Verdeel de organoïden gelijkmatig over de EME door op en neer te pipetteren, vermijd luchtbellen. Pipetteer zes koepels van 50 μl in een weefselkweekschaaltje van 35 mm. Incubeer gedurende 15-20 minuten in de weefselkweekincubator om de EME te laten polymeriseren. Voeg 2 ml van de bereide rIOM toe aan het gerecht. Vervang na 2 dagen de media door rIOM. Het gebruik van Y27632 en CHIR99021 kan worden opgeschort. De groei van organoïden kan traag zijn in de eerste passage na ontdooiing. Het wordt geadviseerd om de organoïden na het ontdooien twee keer te passeren voordat met experimenten wordt begonnen. 5. Genereren van 2D-monolagen in de darm van ratten uit 3D-organoïden OPMERKING: Het volgende protocol beschrijft de volumes die nodig zijn om 24 putjes te genereren van een plaat met 48 putjes bedekt met EME, te beginnen met zes koepels van 50 μL (schaal van 35 mm) met ~300 darmorganoïden/koepel (schaal: één koepel genereert vier putjes), maar kan naar behoefte worden op- of afgeschaald. Zoals geschreven, bereikt dit protocol ~80% samenvloeiing in 4-5 dagen. Bij een hogere samenvloeiing beginnen de cellen weer 3D-organoïdestructuren te verwerven. Bij lage confluentie (≤40%) blijven de cellen als monolagen en zijn ze ~14 dagen levensvatbaar. Als het doel van het onderzoek is om 2D-monolagen te gebruiken, verklein dan zodat één koepel acht putjes van een plaat met 24 putjes genereert. De putjes kunnen ook worden gecoat met collageen I om monolagen te vormen. Voorbereiding van gecoate oppervlakkenOm de plaat met EME te coaten, verdunt u EME 1:20 in koude AdDMEM+ (Tabel 1). Voor coating met collageen, bereid collageen I volgens de instructies van de fabrikant. Verdun 5 mg/ml collageen I in AdDMEM+ tot 100 μg/ml (1:50 in dit geval). Smeer de plaat in met 200 μL verdund EME of collageen om het putoppervlak volledig te bedekken. Incubeer gedurende 1-2 uur bij 37 °C in een weefselkweekincubator. Bereid het darmorganoïde medium van de rat voor op een 2D-monolaagkweek (rIOM2D) volgens tabel 4. Genereren van monolagenZuig het medium op uit een plaat van 35 mm met organoïden. Voeg 1 ml PBS toe. Verstoor de EME in de putten door te krabben met een P1000 tip. Pipette ongeveer 20 keer op en neer om alle EME los te maken. Breng alles over in een conische buis van 15 ml. Voeg 1 ml PBS toe aan de plaat van 35 mm om eventuele extra organoïden te recupereren en over te brengen naar dezelfde conische buis van 15 ml. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 350 x g en zuig het supernatant op, inclusief EME-residu. Voeg 1 ml trypsine-oplossing toe aan de organoïdekorrel en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 °C. Pipeteer 10 keer op en neer met een P1000 tip en voeg 2 ml AdDMEM+ toe om trypsine te neutraliseren. Centrifugeer op 350 x g gedurende 5 min. Zuig het supernatans op en voeg 4,8 ml rIOM2D toe (tabel 4). Resuspendeer de celpellet. Voordat u de organoïden plaatst, verwijdert u overtollig EME of collageen in AdDMEM+ uit de putjes. Voeg vervolgens 200 μL organoïden in rIOM2D en 10 μM Y27632 toe aan elk voorgecoat putje. Vang na 4-16 uur de media op en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g . Breng het supernatans over in een nieuwe conische buis van 15 ml en gooi de pellet weg. Was elk putje met 300 μL PBS en voeg 200 μL van het gecentrifugeerde rIOM2D toe aan elk putje. Vervang de rIOM2D elke 2-3 dagen en schort het gebruik van Y27632 op. Reformeren van 3D organoïden uit 2D monolagenOPMERKING: Monolagen die op EME worden gekweekt, kunnen worden geïnduceerd om 3D-organoïden te hervormen, terwijl monolagen die op collageen I worden gekweekt, niet efficiënt terugkeren naar 3D-organoïden. Gewoonlijk kunnen 2-3 putjes met organoïden gegenereerd uit monolagen worden gebruikt om op dag 5 één koepel van 50 μL EME te maken.Verdun de EME 1:4 in rIOM2D. Wanneer de monolagen ~80% confluentie bereiken, zuigt u de media voorzichtig op en voegt u 100 μL verdunde EME toe aan de putjes die monolagen bevatten. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 in een weefselkweekincubator gedurende 20 min. Voeg daarna 100 μL rIOM2D toe en keer terug naar de weefselkweekincubator. 3D-organoïden worden binnen 5 dagen na toevoeging van verdunde EME gegenereerd. Nadat kleine organoïden zich hebben gevormd (~dag 5), bereid je rIOM voor. Verzamel alle inhoud van de put, pipetter op en neer om de EME te verstoren en breng over naar een conische buis van 15 ml. Centrifugeer op 350 x g gedurende 2 min. Zuig het supernatans en EME-residu op. Voeg 1 ml koude AdDMEM+ toe en centrifugeer gedurende 2 minuten op 350 x g . Verwijder het supernatant en laat ~50 μL media over. Breng de 50 μL media en organoïden over naar een 250 μL EME-aliquot. Pipette op en neer om de organoïden over de EME te verdelen. Pipetteer 50 μL EME-koepels in een schaal van 35 mm en incubeer gedurende 20 minuten in een weefselkweekincubator. Voeg 2 ml rIOM plus 10 μM Y27632 toe. Vervang de groeimedia elke 2-3 dagen. Bij het verwisselen van de media kan Y27632 worden weggelaten. 6. Genetische manipulatie Voorbijgaande transfectie van 2D-monolagenLET OP: Bereid de monolagen van het darmepitheel van ratten volgens rubriek 5.1 in een plaat met 48 putjes. Transfectie moet worden uitgevoerd bij 70%-80% confluentie. Vervang de media in de putjes altijd door 200 μL verse rIOM2D voordat u transfecteert. Bereken de absorptieverhoudingen van 260/280 nm en 260/230 nm van het plasmide-DNA; Deze moeten hoger zijn dan 1,8 om goede transfectieresultaten te garanderen.OPMERKING: Gebruik een plasmidecontrole om de efficiëntie van transfectie te berekenen. Een plasmide dat codeert voor een fluorescerend eiwit wordt voor het gemak aanbevolen. In dit protocol werd pLJM1-EGFP27 gebruikt.Bereid 1 mg/ml 20 kDa polyethylenimine (PEI; Tabel 3). Bereid voor elk putje buisje A (0,6 μg plasmide + 50 μl gereduceerd serummedium) en buisje B (1,8 μl PEI + 50 μl gereduceerd serummedium). Handhaaf een DNA:PEI-verhouding van 1:3. Vortex beide buizen gedurende 30 s. Combineer buis A en buis B, en draai opnieuw gedurende 30 s. Gebruik indien nodig een centrifuge om naar beneden te draaien. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het DNA/PEI-complex voorzichtig druppelsgewijs toe aan de 2D-monolaag. Draai de plaat voorzichtig rond om te mengen. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2. De expressie kan meestal na 24 uur worden gedetecteerd.OPMERKING: Als het nodig is om terug te keren naar 3D-organoïdestructuren, wacht dan 48 uur na transfectie voor het toevoegen van verdunde EME. Lentivirale transductie van darmorganoïden van rattenOPMERKING: Voordat u met lentivirussen gaat werken, moet u de juiste toestemming en gespecialiseerde training van de instelling verkrijgen. Draag altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij het hanteren van lentivirussen. Hoewel hier niet beschreven, is hoogwaardig, geconcentreerd lentivirus essentieel voor de succesvolle infectie van organoïden. Dit protocol maakte gebruik van een lege pLJM1-EGFP-vector27 om oplosbare GFP tot expressie te brengen. Dit protocol is aangepast ten opzichte van een eerder gepubliceerd protocol28. De transductie-efficiëntie hangt af van de kwaliteit en concentratie van virale deeltjes, efficiënte dissociatie van organoïden in kleine celclusters en het gen dat tot expressie wordt gebracht. Berekend 5 dagen na infectie was de gemiddelde transductie-efficiëntie voorafgaand aan de selectie 19,4% (± 6,5% standaarddeviatie).Plan 2 dagen voorafgaand aan de lentivirale infectie om (sectie 3) twee dichte putjes van een plaat met 24 putjes te passeren voor elk lentivirus dat zal worden getransduceerd. Elk putje van een plaat met 24 putjes biedt plaats aan één koepel van 50 μL EME. Zodra de EME stolt, voegt u 0,5 ml rIOM toe, aangevuld met 10 mM nicotinamide, 10 μM Y27632 en 2,5 μM CHIR99021. Dit induceert grote sferoïde morfologieën, wat gunstig is voor de efficiëntie van lentivirale transductie. Binnen 2 dagen na het uitplateren moeten rattenorganoïden grote sferoïden zijn. Als er significante differentiatie (d.w.z. knopvorming) wordt waargenomen, verplaats dan de organoïden. Ontdooi het geconcentreerde virus op ijs. Bereid verse transductiemedia voor, zoals beschreven in tabel 3. Gebruik een P1000-tip om de EME-koepels vanaf de onderkant van de celkweekschaal in de media los te maken door op en neer te pipetteren. Blijf 20 keer op en neer pipetten om de EME op te breken en de organoïden vrij te geven. Pipeteer de organoïden en media in een conisch buisje van 15 ml. Alle putjes kunnen worden samengevoegd, op voorwaarde dat de organoïden hetzelfde genotype hebben en uit dezelfde lijn komen. Was elk putje twee keer met 1 ml koude AdDMEM+. Vang de AdDMEM+ op en breng deze over in dezelfde conische buis van 15 ml. Gebruik een glazen pasteurpipet om de organoïden van de rat mechanisch te verstoren. Dit is een cruciale stap, omdat het doel is om kleine meercellige clusters van cellen. Pipetteer ~30 keer op en neer. Controleer de efficiëntie van de verstoring onder de microscoop met behulp van een 4x objectief. Ga door met dit proces totdat de celsuspensie voornamelijk bestaat uit celclusters met weinig organoïden over.OPMERKING: Als alternatief kunnen organoïden gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 200 x g worden gecentrifugeerd, waarbij het supernatans voorzichtig wordt verwijderd en opnieuw wordt gesuspendeerd in 1 ml recombinant enzym ter vervanging van conventioneel trypsine/EDTA, voorverwarmd tot 37 °C in de weefselkweekincubator. Incubeer de organoïden in trypsinevervanging gedurende 2 minuten in een waterbad van 37 °C, met regelmatige vortexen om dissociatie te bevorderen. Vermijd langdurige incubatie met trypsinevervanging, omdat dit celdood kan bevorderen. Controleer regelmatig de efficiëntie van de verstoring onder de microscoop met behulp van een 4x-objectief. Wanneer de suspensie voornamelijk bestaat uit afzonderlijke cellen met weinig celculturen, verdun dan de trypsinevervanger door 4 ml AdDMEM+ toe te voegen en ga verder met de volgende stap. Draai de conische buis van 15 ml met de celclusters op 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder de supernatant voorzichtig en gooi deze weg, zorg ervoor dat u de celpellet niet verstoort. Resuspendeer de celclusters in 230 μL transductiemedium per te infecteren putje. Gebruik voor de infectie één putje van een plaat met 48 putjes voor elk lentivirus. Plaat 230 μL celsuspensie in elk putje van een gelabelde plaat met 48 putjes. Voeg 20 μL geconcentreerd virus toe aan elk putje. Gebruik een P1000-tip om de virus-/celoplossing in elk putje te mengen en sluit de plaat af met een transparante film. Voer spinoculatie uit: centrifugeer de plaat bij 600 x g gedurende 1 uur bij 32 °C. Maak de verzegeling van de plaat los en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 6 uur. Verwarm een plaat met 24 putjes voor in de incubator van 37 °C. Na de incubatie pipet u elk putje op en neer en brengt u de inhoud over in een gelabeld buisje van 1,5 ml. Was elk putje met 750 μL AdDMEM+ en breng over naar de buis. Draai de buisjes 5 minuten rond op 600 x g bij 4 °C. Haal de buisjes uit de centrifuge en bewaar ze op ijs. Gebruik een P1000-tip om het supernatant voorzichtig te verwijderen en op de juiste manier weg te gooien. Resuspendeer de celpellet in EME en plaats de koepels van 50 μL in de voorverwarmde plaat met 24 putjes. Incubeer gedurende 15-20 minuten bij 37 °C totdat de EME is gepolymeriseerd. Voeg aan elk putje 500 μL rIOM toe, aangevuld met 10 mM nicotinamide, 10 μM Y27632 en 2,5 μM CHIR99021. Vervang het medium 1 dag na infectie door rIOM plus 10 μM Y27632. Vervang de media elke 2-3 dagen. Als er selectie wordt uitgevoerd, voeg dan selectie 48-72 uur na infectie toe. Gebruik voor de selectie van puromycine 2 μg/ml puromycine. 7. Immunofluorescentie kleuring van organoïden Zuig de media op en voeg 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS-Tween 20 (PBS-T) (tabel 3) toe aan de organoïden in een celkweekschaaltje. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Maak de organoïden los uit de EME door op en neer te pipetteren. Verzamel de organoïden in een buisje van 0,75 ml. De organoïden zullen binnen enkele minuten door de zwaartekracht naar de bodem van de buis zakken. Centrifugeer indien nodig gedurende 1 minuut op 100 x g . Verwijder met behulp van een transferpipet de PFA en resuspendeer de organoïden in PBS-T. Laat de organoïden naar de bodem van de buis zakken. Verwijder de PBS-T en resuspendeer in 200 μL blokoplossing (tabel 3). Incubeer bij kamertemperatuur op een rocker of nutator gedurende 45 min. Organoïden kunnen klonteren en naar de bodem van de buis zakken. Veeg regelmatig met uw vinger met de buis om te resuspenderen en door de oplossing te verspreiden. Laat de organoïden naar de bodem van de buis zakken. Centrifugeer indien nodig gedurende 1 minuut op 100 x g . Blokoplossing verwijderen. Voeg primair antilichaam verdund in 100 μL blokoplossing toe. Incubeer bij kamertemperatuur op een notenmenger gedurende 45 minuten bij 24 tpm. Antilichaamconcentraties variëren afhankelijk van het gebruikte antilichaam.OPMERKING: Deze stap kan worden verlengd op basis van het primaire antilichaam, tot ‘s nachts bij 4 °C. Laat de organoïden naar de bodem van de buis zakken. Centrifugeer indien nodig gedurende 1 minuut op 100 x g . Was vijf keer in PBS-T met behulp van een transferpipet. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op de nutating-mixer op 24 tpm. Herhaal deze stap twee keer. Voeg secundair antilichaam verdund 1:200 en 50 μg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund in 100 μL blokoplossing toe. Incubeer bij kamertemperatuur op een notenmenger gedurende 30 minuten bij 24 tpm. Laat de organoïden naar de bodem van de buis zakken. Centrifugeer indien nodig gedurende 1 minuut op 100 x g . Verwijder secundair antilichaam. Was vijf keer in PBS-T met behulp van een transferpipet. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur op een notenmenger op 24 tpm. Herhaal de wasstap twee keer. Terwijl de organoïden aan het wassen zijn, verwarmt u een aliquot VALAP-kit (tabel 3) op 40-50 °C om vloeibaar te maken. Schilder met een penseel een dun vierkant VALAP op een microscoopglaasje ter grootte van een dekglaasje. Gebruik een dekglaasje nr. 1.5 van 22 mm x 22 mm. Knip met een schaar het uiteinde van een P200-pipetpunt af. Breng organoïden over naar de VALAP-put op het objectglaasje. Gebruik een doekje om de PBS-T voorzichtig weg te trekken. Laat de organoïden niet uitdrogen. Spoel de VALAP-put onder water met een antifade-montagemedium (tabel 3). Voor een vierkant van ~22 mm x 22 mm is hiervoor 100-150 μL antifade nodig. De organoïden kunnen clusteren; Draai de antifade met een pipetpunt om de organoïden te herverdelen, indien nodig. Montage met 22 mm x 22 mm nr. 1,5 dekglaasje, vermijd luchtbellen. Verzegel het dekglaasje door een dunne laag VALAP op de randen te schilderen.OPMERKING: Bij omgekeerde microscopen kunnen de organoïden ook in een schaal met glazen bodem van 35 mm worden gemonteerd. 8. Forskolin-geïnduceerde zwelling van darmorganoïden van ratten Kweek de organoïden 3-5 dagen na het passeren in rIOM. Het is raadzaam om organoïden te kweken in een plaat met 24 putjes om ervoor te zorgen dat hetzelfde gebied gemakkelijk opnieuw kan worden afgebeeld. Leg foto’s vast voordat forskolin (T0) wordt toegevoegd. Voeg forskoline (tabel 3) rechtstreeks toe aan de organoïde media tot een eindconcentratie van 10 μM. Voeg hetzelfde volume dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de controleputjes. Breng de controle- en forskolin-behandelde putten met regelmatige tussenpozen en elke 15-30 minuten in beeld. Als er geen beeldvorming is, bewaar dan organoïden in de incubator of gebruik een gecontroleerd beeldvormingssysteem met incubatie. Maximale zwelling moet na 120 minuten in acht worden genomen. Volg standaardprotocollen om de relatieve zwelling te berekenen op basis van de verkregen beelden29.

Representative Results

Organoïden van de twaalfvingerige darm en jejunale rat werden gegenereerd met behulp van het protocol dat in sectie 2 wordt beschreven. Het is erg belangrijk tijdens de stappen van de crypte-isolatie dat villi efficiënt worden uitgeput uit de PBS. Als er te veel villi in de EME worden geplateerd met crypten, kan dit leiden tot de dood van de hele cultuur en het niet tot stand brengen van een organoïdelijn. Daarom is het nuttig om crypten te isoleren onder een ontleedbereik, waardoor visuele bevestiging van uitputting van villar mogelijk is. Figuur 1 toont representatieve villarfragmenten en crypten (Figuur 1A). Let op de aanzienlijk kleinere omvang van crypten in vergelijking met villi (Figuur 1B). Na het plateren zullen de crypten de komende dagen uitzetten tot sferoïden en zullen ze op dag 4-7 beginnen te ontluiken en te differentiëren (Figuur 2). Zodra de organoïden een uitgebreid ontluikend stadium hebben bereikt, moeten ze worden gepasseerd. Tijdens het passeren is het belangrijk om de organoïden voldoende te verstoren om de crypteknoppen uit elkaar te splijten, zodat het aantal organoïden kan worden uitgebreid (Figuur 3B). Het succesvol terugwinnen van organoïden na het invriezen is sterk afhankelijk van de staat waarin ze zijn ingevroren. Organoïden in een zeer proliferatieve ongedifferentieerde toestand herstellen met de hoogste efficiëntie. Daarom raden we aan om ze bolvormig en cystisch te maken in plaats van ontluikt en gedifferentieerd. Om dit te bereiken, kan Wnt hypergeactiveerd worden door de hoeveelheid van het Wnt-ligand R-spondine in de media te verhogen en door nicotinamide in de media op te nemen, waarvan is aangetoond dat het de vorming van organoïden en de overleving van cellen in verschillende kweeksystemenondersteunt30,31. Figuur 3A toont een gezonde organoïdenkweek slechts 2 dagen na ontdooiing. Het opnemen van BSA in de media tijdens het ontdooien heeft ook geholpen bij de overleving van darmorganoïdeculturen van ratten, die kwetsbaarder zijn gebleken dan darmorganoïden van muizen. Hoewel 3D-organoïdekweek vaak de voorkeur heeft omdat het een deel van de normale darmarchitectuur recapituleert, maakt het andere benaderingen, waaronder live beeldvorming, transfecties en lentivirale transducties, technisch uitdagender. Het gebruik van 2D-monolagen gegenereerd uit 3D-organoïden32 (Figuur 4) maakt een efficiëntere introductie van de plasmiden mogelijk. Terwijl 3D-darmorganoïden traditioneel resistent zijn tegen voorbijgaande transfecties, kunnen plasmiden die coderen voor EGFP met succes worden geïntroduceerd met behulp van op lipiden gebaseerde transfectiemethoden. De meest kosteneffectieve aanpak met behulp van PEI wordt beschreven in stap 6.1 (figuur 5), maar elektroporatie en in de handel verkrijgbare transfectiereagentia hebben ook vergelijkbare resultaten opgeleverd (gegevens niet weergegeven). Toekomstige studies zullen zich richten op de vraag of deze benaderingen kunnen worden gebruikt voor het introduceren van CRISPR-constructen in monolagen. Het was belangrijk om 3D-organoïden na transfectie te kunnen hervormen uit 2D-monolagen, zodat ze konden worden gehandhaafd als een doorneembare lijn met 3D-architecturale componenten van crypten. Interessant is dat 2D-monolagen die op de EME waren geplateerd, gemakkelijk werden omgevormd tot kleine sferoïden wanneer EME weer aan de bovenkant van de cellen werd toegevoegd, terwijl een collageen I-substraat niet voldoende was voor de hervorming van 3D-structuren (Figuur 6). Hoewel voorbijgaande transfecties nuttig zijn voor veel onderzoeken, is de vorming van stabiele lijnen vaak nuttiger, waardoor lentivirus in de cellen moet worden geïntroduceerd. Darmorganoïden van ratten werden geïnfecteerd met lentivirus door eerder gepubliceerde protocollen aan te passen (Figuur 7). Een belangrijke stap in het protocol is de verstoring van organoïden in kleine aggregaten of celclusters. Als culturen niet efficiënt worden verstoord en organoïden intact blijven, komen de lentivirale deeltjes niet in de cellen. Na infectie moeten organoïden herstellen en opnieuw groeien. Het hier geschetste protocol maakt de opname van virale deeltjes door 10%-48% (gemiddeld: 19,4% ± 6,5%) van de cellen vóór selectie mogelijk. Het kleuren van organoïden op de hele berg kan moeilijk zijn vanwege onvolledige verwijdering van EME-residu of onvolledige penetrantie van antilichamen. Het hier geschetste protocol maakt het mogelijk om organoïden robuust te kleuren. De visualisatie van organoïden op een confocale microscoop kan ook moeilijk zijn als ze te ver van het dekglaasje verwijderd zijn. Door VALAP te gebruiken, wordt een putje met enige hoogte gecreëerd, zodat organoïden niet worden verpletterd door het dekglaasje, maar toch dicht bij het dekglaasje kunnen bezinken om het beeldvormingsgemak te vergemakkelijken. Representatieve kleuring tegen de apicale anionkanaal, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) en falloidine om F-actine te labelen, wordt weergegeven in figuur 8. Ten slotte zijn organoïden bruikbaar in functionele tests. Van patiënten afgeleide organoïden van patiënten met cystische fibrose zijn gebruikt om de CFTR-functie te screenen, aangezien behandeling met de cAMP-agonist forskoline robuuste CFTR-gemedieerde vloeistofsecretie induceert, waardoor zwelling van organoïden 29,33-37 ontstaat. Een van de doelen van dit werk was het identificeren en ontwikkelen van een organoïdemodel dat parallel aan in vivo preklinische studies kan worden gebruikt. Daarom wilden we bepalen of darmorganoïden van ratten forskoline-geïnduceerde zwelling ondergaan. Inderdaad, binnen 30 minuten na behandeling met forskolin zwollen de organoïden van ratten op, met een maximaal effect waargenomen na 120 minuten (Figuur 9). Figuur 1: Villar-fragmenten en crypten tijdens epitheliale isolatie . (A) Representatief beeld van villar-fragmenten in EDTA-oplossing tijdens het crypte-isolatieprotocol. Gele pijlpunten markeren villar-fragmenten. Rode pijlen tonen crypten die aan een fragment van een villar zijn bevestigd. Let op het verschil in relatieve grootte. (B) Afbeelding met een hogere vergroting van een enkele crypte (rode pijl) zodat de morfologie kan worden gevisualiseerd. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Progressie van de darmorganoïde van ratten. Rattenjejunumcrypten werden onmiddellijk na isolatie in EME geplateerd (A,B). Binnen 2 dagen werden de crypten sferoïden (C,D). Op dag 5 begonnen ze crypteknoppen (E,F) te initiëren, die zich op dag 7 (G) ontwikkelden en groeiden. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Organoïden na ontdooien en passeren. (A) Organoïden van ratten werden ontdooid volgens de geschetste protocollen na cryopreservatie. Let op de aanwezigheid van zowel sferoïden als ontluikende organoïden slechts 2 dagen na het ontdooien. (B) Dezelfde organoïdelijn afgebeeld in A onmiddellijk na het passeren volgens het geschetste protocol. Let op het relatieve verschil in grootte tussen structuren in A en B en de aanwezigheid van enkele crypte-achtige domeinen in B. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: 2D monolayer vorming uit 3D organoïden. (A-C) 2D monolayer progressie op EME. (D-F) 2D monolayer progressie op collageen I. Op dag 5 leverde elke voorwaarde ~80% samenvloeiing op. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Transiënte transfectie van een 2D monolaag. Representatief beeld van een 2D-monolaag gekweekt op EME, tijdelijk getransfecteerd met pLJM1-EGFP-plasmide met behulp van PEI. (A) Helderveld, (B) fluorescentie (GFP), (C) overlay. De rode stippellijn markeert de grens van de monolaag. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Reformatie van 3D-organoïden uit 2D-monolagen op EME. (A) Vorming van 3D-organoïden uit 2D-monolagen gekweekt op EME. Organoïden efficiënt gevormd door 5 dagen na toevoeging van EME aan het apicale oppervlak van de monolaag. Let op de overvloed aan dode cellen rond de kleine 3D-sferoïden. (B) Persistentie van 2D-monolagen 5 dagen nadat collageen I werd toegevoegd aan het apicale oppervlak van 2D-monolagen gekweekt op collageen I. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Lentivirale infectie van 3D-organoïden. Organoïden van rattenjejunum werden geïnfecteerd met nucleaire GFP-lentivirale deeltjes met behulp van het geschetste protocol. Na herstel en groei gedurende 5 dagen werden organoïden gefixeerd en gekleurd met DAPI. (A) DAPI: grijs; nucleairGFP: groen. (B) nucleairGFP:groen. De rode stippellijn markeert de grens van de organoïde. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Immunofluorescentie van de darmorganoïden van ratten. (A) CFTR, (B) falloidine en (C) samengevoegde immunofluorescentie van jejunale organoïden van ratten. Let op de apicale verrijking van CFTR-kleuring in organoïden (grijs in A, magenta in C). Phalloidine markeert F-actine en labelt prominent de apicale penseelrand (grijs in B, cyaan in C). Schaalbalken: 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 9: Darmorganoïden van ratten zwellen op bij forskolinestimulatie. Representatief tijdsverloop van zwelling van de darmorganoïde van de rat na toevoeging van de cAMP-agonist forskoline. De tijd van 0 min vertegenwoordigt het tijdstip onmiddellijk voorafgaand aan de toevoeging van 10 μM forskoline. Afbeeldingen tonen dezelfde organoïde met tussenpozen van 30 minuten. Maximale zwelling werd waargenomen na 120 minuten na toevoeging van forskolin. De rode stippellijn schetst de organoïde grens. Het donkere materiaal in het midden van het organoïde lumen bestaat uit dode cellen. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: AdDMEM+ recept. Ingrediënten om de standaard AdDMEM+ media te maken, wat de basismedia is voor de hier getoonde methoden. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2: Recept voor intestinale organoïde media (rIOM) bij ratten. Gedetailleerd recept van de standaard darmorganoïde media van ratten, inclusief oplosmiddel en bewaarcondities voor recombinante eiwitten. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 3: Oplossingen. Recepten en instructies om andere oplossingen te maken die in het hele protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 4. Rat-darmorganoïdemedium voor 2D-monolaagcultuur (rIOM2D). Aangepast recept van organoïde kweekmedia geoptimaliseerd voor de 2D-groei van monolagen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

De ontwikkeling van een darmorganoïdemodel van ratten behoudt belangrijke functionele kenmerken die in vivo in het orgaan worden aangetroffen en is een veelbelovend hulpmiddel voor preklinische tests, screening van geneesmiddelen en functionele tests. Dit in-vitromodel kan parallel worden gebruikt met in vivo preklinische gastro-enterologische studies, waarvoor ratten vaak een voorkeursmodel zijn vanwege hun grotere darmomvang, gedeelde fysiologische aspecten met mensen en in sommige gevallen betere ziektemodellen38. Hier wordt een robuust stapsgewijs protocol geschetst voor de isolatie van darmcrypten van ratten, het genereren en langdurig kweken van darmorganoïden van ratten, evenals stroomafwaartse toepassingen, waaronder functionele forskoline-zwellingstesten, immunofluorescentie van de hele montage, 2D-monolaagcultuur en lentivirale genetische manipulatie. Intestinale organoïden van ratten zijn waarschijnlijk relevant in veel ziektecontexten waar de pathofysiologie van muismodellen ongepast is en kunnen een beter model bieden voor de menselijke darmfysiologie in vergelijking met darmorganoïden van muizen.

Om langlevende organoïdeculturen tot stand te brengen die kunnen worden gepasseerd en uitgebreid, is het essentieel om de belangrijkste groeifactoren te identificeren die nodig zijn om de proliferatie van het darmepitheel in stand te houden. Muizenorganoïden worden meestal gekweekt in een eenvoudige cocktail van EGF, R-spondin en Noggin, hoewel is gemeld dat Noggin niet nodig is voor darmorganoïdenkweek39. Geconditioneerde media kunnen recombinante groeifactoren vervangen en de meest gebruikte cellijnen zijn L-WRN, dat Wnt3a, Rspondin-3 en Noggin39, L-Wnt3a en HA-Rspondin1-Fc 293T-cellen40 afscheidt. L-WRN geconditioneerde media zijn voldoende om niet alleen de groei van darmorganoïden van muizen39 te ondersteunen, maar ook de groei van darmorganoïden van verschillende boerderijdieren en gezelschapsdieren, waaronder honden, katten, kippen, paarden, koeien, schapen en varkens12. Menselijke darmorganoïden zijn echter zeer verschillend in hun groeifactorvereisten, omdat ze verschillende mediaformuleringen nodig hebben voor hun expansiegroeifase (d.w.z. de progressie van kleine naar grote sferoïden) versus hun differentiatiefase (d.w.z. de generatie en rijping van gedifferentieerde celtypen)10. De mediavereisten van darmorganoïden van ratten komen nauw overeen met die van de expansiegroeimedia voor menselijke darmorganoïden, maar met name organoïden van ratten zijn in staat tot zowel groei als differentiatie in deze media-omgeving, waardoor hun kweekvereisten aanzienlijk worden vereenvoudigd. Terwijl onze eerste pogingen gericht waren op het vestigen en kweken van darmorganoïden van ratten in L-WRN-geconditioneerde media, was de kweek op lange termijn zwak en leden de darmorganoïdelijnen van ratten aan een gebrek aan robuustheid (gegevens niet getoond). Dit kan zijn omdat L-WRN-cellijnen zijn ontworpen om R-spondine 3 af te scheiden, terwijl de 293T-Rspo1-cellijn die hier wordt aanbevolen, is ontworpen om R-spondine 1 af te scheiden. Het is mogelijk dat organoïden van ratten en mensen de voorkeur geven aan R-spondine 1, wat mogelijk verantwoordelijk is voor het falen van organoïdelijnen van ratten in L-WRN-geconditioneerde media.

Om de in vivo setting zo goed mogelijk samen te vatten, is het belangrijk om organoïdekweekcondities te ontwikkelen die overleving, onderhoud en proliferatie van stamcellen mogelijk maken, en die cellulaire vernieuwing en gelijktijdige differentiatiegebeurtenissen in discrete celtypen kunnen handhaven. Daarom moeten de concentraties van recombinante eiwitten en/of eiwitten in geconditioneerde media nauwkeurig worden getitreerd en gecontroleerd om deze perfecte balans te bereiken. Met name optimale Wnt-niveaus zijn essentieel om het verlies van darmorganoïdeculturen te voorkomen. Te weinig Wnt in geconditioneerde media zal niet in staat zijn om de groei te ondersteunen, wat leidt tot een verlies van stamcellen en de daaropvolgende dood van organoïden; overactivering van Wnt zorgt ervoor dat organoïden cystisch en ongedifferentieerd zijn10. Hoewel hier niet gedetailleerd, wordt het sterk aanbevolen om elke batch L-Wnt3a en 293T-Rspo1 geconditioneerde media te testen met behulp van een WNT reporter luciferase assay, zoals een Topflash cell line41. Eerdere studies hebben beschreven dat een optimale batch L-Wnt3a-media zou moeten resulteren in een 15-voudige signaaltoename bij 12,5% en een 300-voudige signaaltoename bij 50%, vergeleken met 1% L-Wnt3a10. Aangezien organoïden van ratten gevoeliger zijn dan organoïden van muizen voor kweekvereisten, met name Wnt-activeringsniveaus, helpen deze extra kwaliteitscontrolestappen aanzienlijk bij het vergemakkelijken van de robuustheid en betrouwbaarheid van organoïdenculturen van ratten. Omdat een vergelijkbare reporterlijn niet beschikbaar is voor het testen van Bmp-activiteit en relatieve Noggin-concentraties in Noggin-geconditioneerde media, is het raadzaam om waar mogelijk recombinant Noggin te gebruiken om de Noggin-niveaus nauwkeurig te controleren. Hoewel darmorganoïden van muizen kunnen worden gekweekt en onderhouden in afwezigheid van Noggin39, is dit niet geprobeerd voor darmorganoïdeculturen van ratten.

Afgezien van de vereisten voor celkweek, hangt de succesvolle eerste vestiging van een organoïdelijn van ratten in hoge mate af van de efficiënte uitputting van gedifferentieerde villi tijdens crypte-isolatie. Hoge niveaus van villar-besmetting veroorzaken de dood van crypten, vermoedelijk als gevolg van signalen van de stervende cellen of sekwestratie van essentiële factoren. Om deze gedifferentieerde villi nauwkeurig en consistent uit epitheelpreparaten te verwijderen, wordt aanbevolen om epitheliale isolaties uit te voeren met behulp van een stereoscoop. Visueel onderzoek van het epitheel dat vrijkomt, geeft een duidelijk signaal wanneer de PBS moet worden weggegooid en vervangen (Figuur 1). Crypten mogen pas worden verzameld als er voldoende uitputting van villi is. Villar-cellen zijn terminaal gedifferentieerd en kunnen geen organoïden in kweek genereren. Bovendien vereist het daaropvolgende passeren van darmorganoïden van ratten en het gebruik ervan voor elke stroomafwaartse toepassing delicate zorg. Incubatie in dissociatiereagentia gedurende langere tijd (10 min) resulteert in significante celdood en verlies van de organoïdelijn.

Hier wordt een eenvoudig en snel protocol beschreven voor het genereren van darmmonolagen uit organoïden van ratten. EME- en collageen I-substraten hebben verschillende effecten op het epitheel, die kunnen worden benut, afhankelijk van het doel van het onderzoek. EME zorgt voor een snelle en efficiënte hechting van afzonderlijke cellen en de vorming van celuitsteeksels. Het coaten van het oppervlak met collageen I daarentegen vertraagt deze processen. Zodra monolagen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, beginnen cellen die op EME worden gekweekt weer 3D-organoïde structuren te genereren. Het ontbreekt ze echter aan voldoende fysieke en chemische ondersteuning voor verdere groei. Deze terugkeer naar de organoïde toestand kan worden voorkomen door monolagen in EME op een confluentie van 50%-80% te houden. De toevoeging van verdunde EME aan het apicale oppervlak van monolagen bevordert het snelle herstel en de vorming van de novo organoïden, waardoor sneller en gemakkelijker convergentiegebieden worden gegenereerd. Op een collageen I-oppervlak kunnen cellen een uniforme monolaag vormen en kleine clusters genereren. De toevoeging van collageen I bovenop monolagen is echter niet voldoende om organoïdevorming te induceren. EME moet worden verdund bij het toevoegen aan het monolaagoppervlak, omdat er een sterkere mechanische weerstand zal zijn voor de ontluikende organoïde om te overwinnen. Deze verdunde EME maakt echter geen robuuste vorming van grote organoïden mogelijk. Alle de novo gegenereerde rattenorganoïden die op natuurlijke wijze loskomen van het oppervlak, moeten onmiddellijk worden verwijderd en overgebracht naar onverdunde EME, zodat structurele ondersteuning en groei kunnen worden hersteld. Vanwege de kleine omvang van de organoïden in deze stap, wordt de passage van organoïden niet aanbevolen totdat een robuuste groei is vastgesteld. De onderliggende biologische betekenis waarom EME de reformatie van organoïden kan ondersteunen, maar of collageen I dit wel of niet kan, is niet duidelijk. Er zijn echter meldingen geweest dat cellen die in 3D-collageen worden gekweekt, geen organoïden met knoppen kunnen vormen42,43 of onderhoud op lange termijn kunnen ondersteunen. In de handel verkrijgbare EME-producten zijn heterogene mengsels van extracellulaire eiwitten, voornamelijk laminine en collageen IV44. Daarom zou de verschillende samenstelling van eiwitten en het vermogen van een epitheelcel om zich bezig te houden met de extracellulaire matrix met behulp van verschillende cellulaire complexen remodellering in EME mogelijk kunnen maken, maar niet in collageen I. Of van collageen I afgeleide monolagen in EME kunnen worden geplaatst om de vorming en groei van organoïden te ondersteunen, is niet getest.

Genetische manipulatie van het darmorganoïdemodel van ratten wordt hier beschreven, en protocollen voor lentivirale transductie van 3D-organoïden en transiënte transfectie van 2D-monolagen worden geschetst. Om de lage efficiëntie van lentivirale organoïdetransductie te ondervangen, werd een protocol ontwikkeld voor de transiënte transfectie van 2D-monolagen. De vlakke morfologie en blootgestelde apicale domeinen van monolagen zorgen voor een gemakkelijkere toegang tot virussen en DNA-bevattende complexen. Voor de validatie van deze techniek werd gebruik gemaakt van de expressie van een EGFP-verslaggever met behulp van de pLJM1-EGFP-vector. De expressie van de GFP-reporter werd na 24 uur waargenomen en werd gedurende 5-6 dagen in monolagen gehandhaafd. Toekomstige studies die zich richten op lentivirale transductie van monolagen zullen waarschijnlijk een hogere efficiëntie hebben dan 3D-organoïdetransductie. Met behulp van de bovenstaande protocollen kunnen 3D-organoïden worden hervormd uit geïnfecteerde 2D-monolagen om het creëren van stabiele lijnen te vergemakkelijken. Met zorg kunnen de darmorganoïdenlijnen van ratten met succes meer dan een jaar worden onderhouden, stabiel blijven gedurende vele passages, gecryopreserveerd, met succes ontdooid en genetisch gemodificeerd met behulp van lentivirale transductie, waardoor wordt ingespeeld op de behoefte aan een toegankelijk en behandelbaar in vitro darmorganoïdemodel dat fysiologische relevantie voor mensen behoudt.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken de leden van de laboratoria van Sumigray en Ameen voor hun doordachte discussies. Dit werk werd ondersteund door een Charles H. Hood Foundation Child Health Grant en een Cystic Fibrosis Foundation-subsidie (004741P222) aan KS en door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases van de National Institutes of Health aan NA onder toekenningsnummer 2R01DK077065-12.

Materials

3-D Culture Matrix Rat Collagen I Cultrex/R&D Systems 3447-020-01
70 µm cell strainer Corning/Falcon 352350
Advanced DMEM/F12 Gibco/Thermo Fisher 12634010
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher 17504044
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
CryoStor Stem Cell Technologies 100-1061
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells R & D Systems 3710-001-01
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Molecular Probes/Thermo Fisher D1306
FBS Gibco/Thermo Fisher 16-000-044
Gastrin I (human) Sigma Aldrich G9145
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 100-0485
Glutamax Thermo Fisher 35-050-061
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free Corning 356231
HEPES AmericanBio AB06021
Lanolin Beantown Chemical 144255-250G
L-glutamine Gibco/Thermo Fisher A2916801
L-Wnt3a cells ATCC CRL-2647
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher 17502-048
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165-5G
Nicotinamide  Sigma Aldrich N0636
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco/Thermo Fisher 31985070
Paraffin Fisher Scientific P31-500
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
PBS Thermo Fisher 10010023
Penicillin/Streptomycin Gibco/Thermo Fisher 15140122
pLJM1-EGFP Addgene 19319
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) Sigma Aldrich 764965
p-phenylenediamine  Acros Organics/Thermo Fisher 417481000
Puromycin VWR J593-25mg
Recombinant human FGF2 protein Peprotech 100-18B-250ug
Recombinant human IGF-1 protein Biolegend B356441
Recombinant human Noggin protein R & D Systems 6057-NG-100
Recombinant mouse EGF protein Thermo Fisher PMG8041
Sprague Dawley rat Charles River Laboratories Strain 001
Triton X-100 American Bioanalytical AB02025-00500
TrypLE Express Enzyme Gibco/Thermo Fisher 12604013
Y27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Yin, Y. -. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -. L. Enteroids for nutritional studies. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143 (2019).
  4. Cai, T., et al. Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth. PLoS One. 13 (2), e0191517 (2018).
  5. Davoudi, Z., et al. Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery. Marine Drugs. 19 (5), 282 (2021).
  6. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  7. Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. Mini-gut: a promising model for drug development. Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).
  8. Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism – update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
  9. Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation. Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
  11. Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
  12. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  13. Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum. Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).
  14. Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).
  15. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  16. Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes. Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).
  17. Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse. Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).
  18. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
  19. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  20. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  21. Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).
  22. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  23. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  24. Hedrich, W. D., et al. Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications. Toxicology. 446, 152614 (2020).
  25. How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html (2023)
  26. How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html (2023)
  27. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  28. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
  29. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
  30. Regent, F., et al. Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351 (2022).
  31. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  32. Breau, K. A., et al. Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells. Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).
  33. Berkers, G., et al. Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis. Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).
  34. deWinter-de Groot, K. M., et al. Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations. Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).
  35. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
  36. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  37. van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. Intestinal organoids to model cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379 (2019).
  38. Tong, T., et al. Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells. Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).
  39. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  40. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  41. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  42. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9 (9), e107814 (2014).
  43. Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels. Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).
  44. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).

Tags

Rat Intestinal OrganoidsGenetic ManipulationLentiviral InfectionTransient TransfectionIntestinal BiologyMouse Intestinal OrganoidsHuman Intestinal OrganoidsPhysiological RelevanceDisease ModelingDrug DiscoveryPersonalized TreatmentStem Cell DynamicsCell Fate Decisions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen, N. A., Sumigray, K. Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (196), e65343, doi:10.3791/65343 (2023).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image