大鼠肠道类器官的产生和操作

注意：所有细胞培养物都应在组织培养罩中使用适当的无菌技术进行处理。本研究中的所有动物工作均已获得耶鲁大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。 1.细胞培养试剂的制备 按照制造商的说明准备 R-spondin 1 条件培养基。按照制造商的说明准备 Wnt3a 条件培养基。如 表 1 所述准备 AdDMEM+。 将胃泌素重悬于无菌dH2O中以制备100μM原液。分装并储存在-80°C。 将N-乙酰半胱氨酸重悬于无菌水中，制备100mM原液。分装并在-20°C下储存长达1个月。 将重组人Noggin重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）+ 0.1%牛血清白蛋白（BSA）中，以制备250μg/ mL储备液。分装并储存在-80°C。 将重组小鼠表皮生长因子 （EGF） 重悬于 PBS + 0.1% BSA 中以制备 100 μg/mL 原液。分装并储存在-80°C。 在 PBS + 0.1% BSA 中稀释重组人 IGF-1 以制备 100 μg/mL 储备液。分装并储存在-80°C。 将重组人 FGF-2 重悬于 5 mM Tris（pH 7.6）中，以制备 100 μg/mL 储备液。分装并储存在-80°C。注意：对于所有生长因子，在PBS + 0.1%BSA中使用中间稀释液至培养基中最终浓度的100倍。储存在-20°C。 2. 大鼠小肠类器官的建立 注：该方案是从先前发表的两个大鼠肠道类器官方案23,24修改而来的。 根据 表2 制备大鼠肠道类器官培养基（rIOM），并将水浴设置为37°C。 该完全培养基在4°C下可稳定保存5天。 在 15 mL 锥形管中制备 10 mL 3 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 的 PBS 溶液，并保持在冰上。在冰上解冻 250 μL 细胞外基质提取物 （EME）。 禁食一只老鼠过夜 ，随意 喝水。根据IACUC批准的方案对大鼠实施安乐死。在该方案中，成年雄性Sprague Dawley大鼠（体重~200g） 通过 CO2 吸入（材料表）实施安乐死。宫颈脱位被用作安乐死的次要方法。 使用无菌高压灭菌的镊子和解剖剪刀进行解剖。将安乐死的大鼠放在腹侧的解剖面上。用镊子捏住皮肤层;以下切口应在表面进行，因此它们只能切开该皮肤层，而不足以损坏内脏器官。 要打开腹腔，使用大而锋利的解剖剪刀，在腹部中央切开一个大的、纵向的、表面水平的切口，穿过皮肤层。接下来，从该切口开始，进行两个较短的水平切口，每侧一个。用镊子将皮肤剥离，露出腹腔。切开腹膜，使腹腔内的内脏器官完全暴露，并随时进入肠道。 使用剪刀和镊子，找到胃并识别其远端约 2-3 厘米处的十二指肠，该十二指肠呈淡黄色部分。空肠近端位于 Treitz 韧带远端约 4-5 cm，是十二指肠和空肠之间的标志。 将分离的肠碎片放入10厘米的培养皿中。尽可能清洁所需的肠系膜肠段。用 10 mL 冰冷的 PBS 冲洗，直至清除管腔内容物。在纸巾上，将肠段切成~2厘米长的块。纵向打开每个肠块，露出上皮。 使用玻璃显微镜载玻片，刮擦暴露的管腔表面以去除绒毛。将肠块放入冰上准备好的EDTA溶液中。在设置为10rpm的管状左轮手枪上在4°C下旋转30分钟。 在解剖显微镜下，将锥形管的内容物倒入10cm培养皿中。再加入 ~5 mL 冰冷的 PBS。 使用细镊子，握住肠段并用力摇晃。将有可能看到上皮释放到 PBS 中。首先，PBS将主要包含绒毛。 继续摇晃。定期丢弃含有绒毛的PBS，并向肠道碎片中加入10mL新鲜冰冷的PBS。继续摇晃碎片并重复此洗涤步骤，直到绒毛不再释放到PBS中，而是PBS主要含有隐窝。隐窝分离不要超过15分钟，以免影响细胞活力。 丢弃剩余的肠道碎片。富集培养皿中剩余的PBS，用于肠隐窝。在组织培养罩中，收集含有PBS的隐窝并通过70μm细胞过滤器过滤（材料表）。 以250× g 离心5分钟。除去上清液，将沉淀重悬于 5 mL AdDMEM+ 中。再次以250× g 离心5分钟。注意： 建议使用带有摆动桶转子的离心机。 除去上清液，留下 ~50 μL 带有沉淀的培养基。将沉淀重悬于剩余的培养基中，并加入冰上EME的等分试样中。轻轻地上下移液，以在整个EME中均匀地悬挂隐窝。避免引入气泡。 将50μLEME圆顶接种到35mm组织培养皿中，并在37°C，5%CO2 组织培养箱中孵育20分钟。 加入含有10μM Y27632和10μM CHIR99021（表3）的2mL rIOM（表2）。传代后，可以停用Y27632和CHIR99021。 每 2-3 天更换一次 rIOM。根据需要传代，通常在 3-7 天之间，具体取决于类器官的初始数量、大小和生长速度。 3. 传代大鼠肠道类器官 在冰上解冻250μL等分试样的EME，并将rIOM预热至37°C。 从含有类器官的 35 mm 板中吸出培养基，并加入 1 mL 解离试剂，立即从 EME 圆顶中释放类器官。 立即将含有片段化类器官的解离试剂转移到 15 mL 锥形管中。用 2 mL AdDMEM+ 洗涤培养板，并加入到含有片段化类器官的 15 mL 锥形管中。 用玻璃巴斯德移液管，轻轻上下移液 15-20 次以碎裂类器官。以350× g 离心2分钟。 将 ~50 μL 溶液从锥形管底部加入 EME。轻轻上下移液以混合。避免制造气泡。 将 50 μL EME 圆顶接种到 35 mm 培养皿中，并在 37 °C、5% CO2 组织培养箱中孵育 20 分钟。 加入含有 10 μM Y27632 和 10 μM CHIR99021 的 2 mL rIOM。每 2-3 天更换一次生长培养基。更换介质时，可以省略 Y27632 和 CHIR99021。 4. 大鼠肠道类器官的冷冻保存和解冻 冷冻保存大鼠肠道类器官注：冻存方案是从之前针对人类和小鼠类器官的方案修改而来的 25.在冷冻之前，类器官在原代培养中必须至少有两次传代。建议在冷冻保存之前将类器官培养到大球状体或略微出芽的类器官，因为这将导致解冻后活类器官的产量更高。这可以通过将R-spondin条件培养基增加到15%和/或通过向类器官培养物中加入10mM烟酰胺（表3）来实现。使用显微镜，计算35毫米培养皿上的类器官数量。标记冷冻管，使每个冷冻管中等分 200 个类器官。 从 35 毫米培养皿中取出 rIOM。用 2 mL 冷组织培养级 PBS 代替。 使用 P1000 吸头，通过上下移液将 EME 圆顶从培养皿底部释放到 PBS 中。继续上下移液 ~20 次以分解 EME 并释放类器官。将类器官和 PBS 收集到 15 mL 锥形管中。 将 2 mL 冷 PBS 加入培养皿中，上下移液以将任何剩余的类器官释放到 PBS 中。将 PBS 转移到 15 mL 锥形管中。 通过以290× g 离心5分钟来沉淀类器官。在不破坏类器官沉淀的情况下取出并丢弃上清液。 通过在 5 mL 冷的 AdDMEM+ 中轻轻重悬来洗涤沉淀。以200× g 离心4分钟。小心地取出并丢弃上清液。 将类器官沉淀重悬于每 200 个类器官的 1 mL 冷冷冻培养基中。将 1 mL 类器官分装在每个标记的冻存管的冷冻培养基中。将冷冻管放入冷冻容器中。 将类器官储存在-80°C的冷冻容器中24小时，然后将冷冻管转移到液氮中长期储存。 解冻大鼠肠道类器官注：该方案是从先前用于解冻人和小鼠肠道类器官的方案修改而来的26。在冰上解冻 250 μL 等分试样的 EME。制备补充有 15% R-spondin 条件培养基、10 μM Y27632 和 10 μM CHIR99021的 rIOM。在37°C下加热。 在室温下将 2 mL 解冻培养基（表 3）加入 15 mL 锥形管中。 通过将小瓶置于37°C水浴中，直到小瓶几乎完全解冻，从液氮中取出并解冻一小瓶类器官。 向小瓶中加入 1 mL 解冻培养基，并将所有内容物转移到含有解冻培养基的锥形管中。用 1 mL 解冻培养基洗涤小瓶两次，然后转移到锥形管中。 以200× g 离心5分钟。吸出培养基，留下 ~50 μL 含有类器官的培养基。将含有类器官的培养基转移到 250 μL 的 EME 中。 通过上下移液将类器官均匀分布在EME中，避免气泡。将 6 个 50 μL 圆顶移液到 35 mm 组织培养皿中。 在组织培养箱中孵育15-20分钟，使EME聚合。将 2 mL 准备好的 rIOM 加入培养皿中。 2 天后，将介质更换为 rIOM。Y27632和CHIR99021可以暂停使用。类器官在解冻后的第一次传代中生长可能缓慢。建议在开始实验之前在解冻后通过类器官两次。 5. 从3D类器官生成大鼠肠道2D单层 注：以下方案描述了产生涂有EME的48孔板的24孔所需的体积，从六个50μL（35mm培养皿）的圆顶开始，其中包含~300个肠类器官/圆顶（规模：一个圆顶产生四个孔），但可以根据需要放大或缩小。如上所述，该协议在 4-5 天内达到 ~80% 的汇合度。在更高的汇合度下，细胞再次开始获得 3D 类器官结构。在低汇合度（≤40%）下，细胞保持单层状态，存活~14天。如果研究的目的是使用 2D 单层，请按比例缩小，使一个圆顶产生 8 个 24 孔板的孔。孔中也可以涂有胶原蛋白I以形成单层。 涂层表面的准备要用EME涂覆板，请在冷AdDMEM +中按1：20稀释EME（表1）。对于胶原蛋白包衣，请根据制造商的说明准备胶原蛋白 I。将 AdDMEM+ 中的 5 mg/mL 胶原蛋白 I 稀释至 100 μg/mL（本例中为 1：50）。 用 200 μL 稀释的 EME 或胶原蛋白涂覆板以完全覆盖孔表面。在37°C下在组织培养箱中孵育1-2小时。如 表4所述制备大鼠肠道类器官培养基用于2D单层培养（rIOM2D）。 单层的生成从含有类器官的 35 mm 板中吸出培养基。加入 1 mL PBS。 用 P1000 吸头划伤孔中的 EME。上下移液器约 20 次以松开所有 EME。将所有东西转移到 15 mL 锥形管中。 向 35 mm 板中加入 1 mL PBS 以回收任何其他类器官并转移到相同的 15 mL 锥形管中。 以350× g 离心2分钟并吸出上清液，包括EME残留物。向类器官沉淀中加入1mL胰蛋白酶溶液，并在37°C下孵育2分钟。 使用 P1000 吸头上下移液 10 次，并加入 2 mL AdDMEM+ 以中和胰蛋白酶。 以350× g 离心5分钟。吸出上清液并加入4.8mL rIOM2D（表4）。重悬细胞沉淀。 在放置类器官之前，从孔中取出 AdDMEM+ 中多余的 EME 或胶原蛋白。然后，在每个预包被孔中加入 200 μL rIOM2D 中的类器官和 10 μM Y27632。 4-16小时后，收集培养基并以1,000× g 离心1分钟。将上清液转移到新的 15 mL 锥形管中，弃去沉淀。 用 300 μL PBS 洗涤每个孔，并向每个孔中加入 200 μL 离心的 rIOM2D。每 2-3 天更换一次 rIOM2D，暂停使用 Y27632。 从 2D 单层重整 3D 类器官注意：在EME上生长的单层可以被诱导重组3D类器官，而在胶原蛋白I上生长的单层不能有效地返回到3D类器官。通常，在第 5 天，可以使用 2-3 个由单层生成的类器官孔来制作一个 50 μL EME 的圆顶。在 rIOM2D 中以 1：4 稀释 EME。当单层达到~80%汇合度时，小心地吸出培养基，并将100μL稀释的EME加入含有单层的孔中。 在37°C，5%CO2 在组织培养箱中孵育20分钟。之后，加入 100 μL rIOM2D 并返回组织培养箱。3D 类器官将在添加稀释的 EME 后 5 天内生成。 小类器官重组后（~第 5 天），制备 rIOM。收集所有孔内容物，上下移液以破坏 EME，然后转移到 15 mL 锥形管中。 以350× g 离心2分钟。吸出上清液和EME残留物。 加入 1 mL 冷 AdDMEM+ 并以 350 x g 离心 2 分钟。除去上清液，留下~50μL培养基。 将 50 μL 培养基和类器官转移到 250 μL EME 等分试样中。上下移液器以将类器官分布在整个 EME 中。 将 50 μL EME 圆顶移液到 35 mm 培养皿中，并在组织培养箱中孵育 20 分钟。 加入 2 mL rIOM 加 10 μM Y27632。每 2-3 天更换一次生长培养基。更换介质时，可以省略 Y27632。 6. 基因操作 瞬时转染 2D 单层注意：按照第 5.1 节在 48 孔板中制备大鼠肠上皮单层。转染必须以 70%-80% 的汇合度进行。转染前，务必用 200 μL 新鲜 rIOM2D 替换孔中的培养基。计算质粒DNA的260/280nm和260/230nm吸光度比;这些值必须高于 1.8 才能确保良好的转染结果。注：使用质粒对照计算转染效率。为方便起见，建议使用编码荧光蛋白的质粒。在该协议中，使用pLJM1-EGFP27 。制备 1 mg/mL 的 20 kDa 聚乙烯亚胺 （PEI; 表3）。对于每个孔，准备管A（0.6μg质粒+ 50μL还原血清培养基）和管B（1.8μLPEI + 50μL还原血清培养基）。保持 DNA：PEI 比例为 1：3。 涡旋两个管30秒。将管A和管B合并，再次涡旋30秒。如有必要，使用离心机降速。在室温下孵育20分钟。 轻轻地将DNA/PEI复合物逐滴添加到2D单层中。轻轻旋转盘子进行混合。在37°C，5%CO2下孵育。通常可以在24小时后检测到表达。注意：如果需要返回 3D 类器官结构，请在转染后等待 48 小时以添加稀释的 EME。 大鼠肠道类器官的慢病毒转导注意：在使用慢病毒之前，请从该机构获得适当的授权和专业培训。处理慢病毒时，务必穿戴适当的个人防护装备 （PPE）。虽然这里没有概述，但高质量、浓缩的慢病毒对于类器官的成功感染至关重要。该协议使用空的pLJM1-EGFP载体27 表达可溶性GFP。该协议是从先前发布的协议修改而来的28.转导效率取决于病毒颗粒的质量和浓度、类器官解离成小细胞簇的有效程度以及表达的基因。在感染后 5 天计算时，选择前的平均转导效率为 19.4%（± 6.5% 标准差）。在慢病毒感染前 2 天，计划为将要转导的每种慢病毒传代（第 3 节）两个 24 孔板的致密孔。24 孔板的每个孔可容纳一个 50 μL 圆顶 EME。 EME 凝固后，加入补充有 10 mM 烟酰胺、10 μM Y27632 和 2.5 μM CHIR99021的 0.5 mL rIOM。这诱导了大的球状体形态，这有利于慢病毒转导的效率。在接种后 2 天内，大鼠类器官应为大球状体。如果观察到明显的分化（即出芽），则重新传代类器官。 将浓缩的病毒在冰上解冻。根据 表3制备新鲜的转导培养基。 使用 P1000 吸头，通过上下移液将 EME 圆顶从细胞培养皿底部释放到培养基中。继续上下移液 20 次以分解 EME 并释放类器官。 将类器官和培养基移液到 15 mL 锥形管中。所有孔都可以汇集在一起，前提是类器官具有相同的基因型并且来自同一系。 用 1 mL 冷 AdDMEM+ 洗涤每个孔两次。收集 AdDMEM+ 并将其转移到同一个 15 mL 锥形管中。 使用玻璃巴斯德移液管，机械地破坏大鼠类器官。这是关键的一步，因为目标是小型的多细胞细胞簇。上下移液~30次。使用4倍物镜在显微镜下检查破坏的效率。继续这个过程，直到细胞悬液主要由细胞簇组成，只剩下很少的类器官。注：或者，类器官可以在室温下以200× g 离心5分钟，小心地除去上清液，并重悬于1mL重组酶中，替代常规胰蛋白酶/ EDTA，在组织培养箱中预热至37°C。将类器官在胰蛋白酶替代物中在37°C水浴中孵育2分钟，定期涡旋以促进解离。避免与胰蛋白酶替代物长时间孵育，因为这会促进细胞死亡。定期使用4倍物镜在显微镜下检查破坏效率。当悬浮液主要由单细胞组成，细胞培养物很少时，通过加入 4 mL AdDMEM+ 稀释胰蛋白酶替代物，然后继续执行以下步骤。 在4°C下以200× g 旋转含有细胞簇的15mL锥形管5分钟。 小心地取出并丢弃上清液，注意不要干扰细胞沉淀。 将细胞簇重悬于每孔 230 μL 要感染的转导培养基中。对于感染，对每个慢病毒使用一个 48 孔板孔。 将 230 μL 细胞悬液接种到标记的 48 孔板的每个孔中。向每个孔中加入 20 μL 浓缩病毒。使用 P1000 吸头在每个孔中混合病毒/细胞溶液，并用透明薄膜密封板。 进行旋吸：在32°C下以600× g 离心板1小时。 打开板封，在37°C，5%CO2 下孵育6小时。 在37°C培养箱中预热24孔板。 孵育后，上下移液每个孔，并将内容物转移到标记的 1.5 mL 试管中。用 750 μL AdDMEM+ 洗涤每个孔并转移到试管中。在4°C下以600× g 旋转试管5分钟。 从离心机中取出试管并储存在冰上。使用 P1000 吸头小心地取出并妥善处理上清液。 将细胞沉淀重悬于EME中，并将50μL圆顶板放入预热的24孔板中。在37°C孵育15-20分钟，直到EME聚合。 向每个孔中加入 500 μL 补充有 10 mM 烟酰胺、10 μM Y27632 和 2.5 μM CHIR99021的 rIOM。 感染后 1 天用 rIOM 加 10 μM Y27632 替换培养基。每 2-3 天更换一次介质。如果要进行选择，请在感染后 48-72 小时添加选择。对于嘌呤霉素的选择，使用 2 μg/mL 嘌呤霉素。 7. 类器官的免疫荧光全镶嵌染色 吸出培养基，将PBS-吐温20（PBS-T）中的4%多聚甲醛（PFA）（表3）添加到细胞培养皿中的类器官中。在室温下孵育10分钟。 通过上下移液从EME中释放类器官。将类器官收集到 0.75 mL 试管中。类器官将在几分钟内通过重力沉降到管子底部。如果需要，以100× g 离心1分钟。 使用移液管，除去PFA并将类器官重悬于PBS-T中。让类器官沉降到管子底部。取出PBS-T并重悬于200μL块溶液中（表3）。 在室温下在摇杆或章动器上孵育45分钟。类器官可以结块并沉降到管的底部。定期用手指轻弹试管以重悬并分散在整个溶液中。 让类器官沉降到管子底部。如果需要，以100× g 离心1分钟。去除块状溶液。 加入在 100 μL 模块溶液中稀释的一抗。在室温下在章动混合器上以24rpm孵育45分钟。抗体浓度因所用抗体而异。注意：该步骤可以根据一抗延长至4°C过夜。 让类器官沉降到管子底部。如果需要，以100× g 离心1分钟。 使用移液管在PBS-T中洗涤五次。在室温下以24rpm的速度在章动混合器上孵育5分钟。重复此步骤两次。 加入 1：200 稀释的二抗和 50 μg/mL 在 100 μL 封闭溶液中稀释的 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）。在室温下在章动混合器上以24rpm孵育30分钟。 让类器官沉降到管子底部。如果需要，以100× g 离心1分钟。去除二抗。使用移液管在PBS-T中洗涤五次。 在室温下以24rpm的速度在章动混合器上孵育5分钟。重复洗涤步骤两次。 洗涤类器官时，在40-50°C下加热VALAP密封剂（表3）以液化。使用画笔，在显微镜载玻片上画一个薄的VALAP正方形，大小与盖玻片差不多。使用 22 mm x 22 mm 1.5 号盖玻片。 用剪刀剪掉P200移液器吸头的末端。将类器官转移到载玻片上的 VALAP 孔中。使用纸巾擦拭，小心地吸走PBS-T。不要让类器官变干。 用抗淬灭封固剂填充VALAP孔（表3）。对于 ~22 mm x 22 mm 的正方形，这将需要 100-150 μL 的抗淬灭剂。 类器官可以聚集;如有必要，用移液器吸头旋转抗淬灭剂以重新分配类器官。使用 22 mm x 22 mm 1.5 号盖玻片安装，避免气泡。通过在边缘涂上一层薄薄的VALAP来密封盖玻片。注意：对于倒置显微镜，类器官也可以安装在 35 mm 玻璃底培养皿中。 8.毛喉素诱导的大鼠肠道类器官肿胀 在 rIOM 中传代后培养类器官 3-5 天。建议在 24 孔板中培养类器官，以确保可以轻松重新成像同一区域。在添加毛喉素（T0）之前捕获图像。 将毛喉素（表3）直接加入类器官培养基中至终浓度为10μM。 向对照孔中加入相同体积的二甲基亚砜（DMSO）。 每15-30分钟定期对控制孔和毛喉素处理的孔进行成像。不成像时，将类器官保留在培养箱中或使用受控成像系统进行孵育。应在120分钟观察到最大肿胀。 按照标准方案从采集的图像中计算相对膨胀29.