Un ensemble de techniques de dépistage pour un aperçu rapide de la fonction des neutrophiles
Summary
Ce protocole comprend un ensemble de tests fonctionnels des neutrophiles à utiliser comme méthode de criblage pour couvrir les fonctions de différentes voies de signalisation. Le protocole comprend une évaluation initiale et simple de la viabilité cellulaire, de la pureté, de la production d’espèces réactives de l’oxygène, de la migration en temps réel, de la phagocytose et d’une suggestion préliminaire de pièges extracellulaires à neutrophiles.
Abstract
Les neutrophiles sont connus comme l’une des premières lignes de défense de la réponse immunitaire innée et peuvent remplir de nombreuses fonctions cellulaires particulières, telles que la chimiotaxie, la migration inverse, la phagocytose, la dégranulation des enzymes et des métabolites cytotoxiques et la libération d’ADN sous forme de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Les neutrophiles ont non seulement une signalisation étroitement régulée, mais participent également à la régulation d’autres composants du système immunitaire. Comme les neutrophiles frais sont différenciés en phase terminale, de courte durée de vie et très variables d’un individu à l’autre, il est important de tirer le meilleur parti des échantillons collectés. Les chercheurs doivent souvent effectuer des tests de dépistage pour avoir une vue d’ensemble des nombreuses fonctions des neutrophiles qui peuvent être affectées par des conditions spécifiques en cours d’évaluation. Une série de tests suivant un seul processus d’isolement de neutrophiles de densité normale a été développée pour répondre à ce besoin, en recherchant un équilibre entre la rapidité, l’exhaustivité, le coût et la précision. Les résultats peuvent être utilisés pour raisonner et guider des études de suivi approfondies. Cette procédure peut être réalisée dans un temps moyen de 4 h et comprend l’évaluation de la viabilité cellulaire, de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), de la migration en temps réel et de la phagocytose de la levure sur des lames de verre, laissant suffisamment de cellules pour des approches plus détaillées telles que les études omiques. De plus, la procédure comprend un moyen d’observer facilement une suggestion préliminaire de TNE après une coloration panoptique rapide observée par microscopie optique, avec un manque de marqueurs spécifiques, mais suffisamment pour indiquer si des efforts supplémentaires dans ce sens en vaudraient la peine. La diversité des fonctions testées combine des points communs entre les tests, réduisant ainsi le temps et les coûts d’analyse. La procédure a été nommée NeutroFun Screen, et bien qu’elle ait des limites, elle équilibre les facteurs susmentionnés. De plus, l’objectif de ce travail n’est pas d’établir un ensemble de tests défini, mais plutôt une ligne directrice qui peut être facilement adaptée aux ressources et aux exigences de chaque laboratoire.
Introduction
Les neutrophiles sont les cellules immunitaires innées les plus abondantes dans le sang humain et sont connues pour jouer un rôle majeur dans l’infection et l’inflammation, étant les premiers intervenants à arriver sur le site des lésions tissulaires1. Ces dernières années, il y a eu une reconnaissance croissante du rôle crucial que jouent les neutrophiles dans une variété de maladies et dans le soutien de l’homéostasie2. Les neutrophiles ont non seulement une signalisation étroitement régulée, mais participent également à la régulation d’autres composants du système immunitaire 3,4,5. Par conséquent, l’étude des neutrophiles et de leurs nombreuses fonctions cellulaires inhabituelles, telles que la chimiotaxie, la migration inverse6, la phagocytose7, l’explosion respiratoire8 et la libération de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE)7, est impérative dans de nombreux contextes de recherche où il est nécessaire d’évaluer les changements fonctionnels, morphologiques ou moléculaires potentiels des neutrophiles déclenchés par des conditions spécifiques en cours d’analyse.
Les neutrophiles fraîchement isolés sont différenciés en phase terminale, de courte durée, très dynamiques et facilement activés9. Cependant, une méthode de stockage efficace qui n’affecte pas les réponses des neutrophiles n’a pas encore été mise au point, ce qui rend difficile la réalisation de plusieurs tests qui doivent être ininterrompus. De plus, les analyses fonctionnelles décrites précédemment10,11, basées sur des tests qui nécessitent une cytométrie et/ou une coloration fluorescente, peuvent ne pas être un choix viable lorsqu’une évaluation large et initiale du neutrophile est nécessaire.
Pour répondre à ces questions, ce protocole décrit un ensemble de tests qui peuvent être effectués à la suite d’un seul processus d’isolement, y compris l’évaluation de la viabilité cellulaire, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), la migration en temps réel et la phagocytose de Saccharomyces cerevisiae, dont les résultats peuvent être utilisés pour raisonner des études de suivi approfondies. Cette procédure, baptisée NeutroFun Screen, a été conçue pour englober les principales activités effectrices, à l’exception de la dégranulation, et peut être réalisée en un temps moyen de 4 h, dont 1 h d’activation. De plus, les cellules restantes peuvent être utilisées pour des approches plus détaillées telles que des études omiques. L’avantage de cette méthode réside dans son équilibre entre la rapidité, l’exhaustivité, le coût et la précision.
De plus, il existe un moyen d’observer facilement une suggestion préliminaire de TNE, sans marqueurs spécifiques, mais suffisamment pour indiquer si des efforts supplémentaires dans cette direction en vaudraient la peine. La diversité des fonctions testées vise à combiner les points communs entre les tests, réduisant ainsi le temps et les coûts d’analyse. L’objectif principal de cette méthode est de fournir une analyse fonctionnelle équilibrée en ce qui concerne la vitesse, l’exhaustivité, le coût et la précision qui permet d’avoir une vue d’ensemble de la réponse du neutrophile, ce qui en fait une première étape utile dans l’étude des effets de nouveaux stimuli sur les neutrophiles de densité normale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les neutrophiles sont des cellules très dynamiques et réactives qui ont une courte durée de vie et ne peuvent pas encore être cryoconservées19, ce qui rend difficile l’étude de leur biologie. Par conséquent, il est essentiel de suivre des étapes minutieuses pour obtenir des neutrophiles viables, enrichis et au repos11,20. Cette étude a utilisé une technique d’isolement basée sur la densité qui met l’accent sur une manipul…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les organismes subventionnaires suivants : FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP et FINATEC.
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
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