Injeções intracerebroventriculares à mão livre em camundongos
Summary
Aqui, uma abordagem simples e rápida para a realização de injeções intracerebroventriculares em camundongos usando uma abordagem à mão livre (ou seja, sem um dispositivo estereotáxico) é descrita.
Abstract
A investigação de sistemas neuroendócrinos muitas vezes requer a entrega de drogas, vírus ou outros agentes experimentais diretamente no cérebro de camundongos. Uma injeção intracerebroventricular (ICV) permite a entrega generalizada do agente experimental em todo o cérebro (particularmente nas estruturas próximas aos ventrículos). Aqui, métodos para fazer injeções de ICV à mão livre em camundongos adultos são descritos. Usando pontos de referência visuais e táteis nas cabeças de camundongos, as injeções nos ventrículos laterais podem ser feitas de forma rápida e confiável. As injeções são feitas com uma seringa de vidro mantida na mão do experimentador e colocada a distâncias aproximadas dos pontos de referência. Assim, esta técnica não requer um quadro estereotáxico. Além disso, essa técnica requer apenas uma breve anestesia com isoflurano, o que permite a avaliação subsequente do comportamento e/ou fisiologia de camundongos em camundongos acordados e com comportamento livre. A injeção de ICV à mão livre é uma ferramenta poderosa para a entrega eficiente de agentes experimentais no cérebro de camundongos vivos e pode ser combinada com outras técnicas, como amostragem frequente de sangue, manipulação de circuitos neurais ou gravação in vivo para investigar processos neuroendócrinos.
Introduction
A entrega de agentes experimentais, como drogas1, vírus2 ou células3, ao cérebro é muitas vezes necessária para a pesquisa neuroendócrina. Se o agente não atravessar prontamente a barreira hematoencefálica ou o objetivo experimental for testar especificamente os efeitos centrais do agente, é importante ter um método confiável para administrar injeções no cérebro. Além disso, a injeção no espaço intracerebroventricular (ICV) oferece a oportunidade de distribuir amplamente o agente no cérebro e fornece uma grande área alvo, aumentando assim a probabilidade de injeção bem-sucedida2.
Um método comum para fazer injeções de ICV envolve a colocação de uma cânula de permanência permanente. Nesta abordagem, uma estrutura estereotáxica é necessária para posicionar a cânula comercialmente disponível ou feita sob medida, pois a cânula é colada ou cimentada no lugar. Muitas vezes, após a recuperação, uma dose suprafisiológica de angiotensina II é administrada através da cânula e, se o comportamento de beber for imediatamente observado, a cânula é considerada corretamente colocada4. Esta abordagem tem muitas vantagens, incluindo a capacidade de realizar infusão a longo prazo e a capacidade de injetar o mesmo animal várias vezes; além disso, se a angiotensina II for empregada, o posicionamento correto pode ser confirmado antes da administração de compostos experimentais. No entanto, existem algumas limitações para a colocação de uma cânula permanente, incluindo a necessidade de equipamentos caros (estrutura estereotáxica), a possibilidade de danos à cânula após a colocação (por exemplo, ratos podem mastigar a cânula de um companheiro de gaiola) e a possibilidade de infecções ao redor da cânula permanente. Injeções únicas de VCI podem ser feitas com o uso de um quadro estereotáxico3, que, embora eficaz, requer exposição substancial à anestesia e, portanto, pode obscurecer alguns efeitos fisiológicos e comportamentais agudos do tratamento. Além disso, a colocação de camundongos em um quadro estereotáxico requer treinamento substancial para alcançar uma colocação estável e evitar o rompimento dos canais auditivos.
Aqui, um método estabelecido para fazer injeções à mão livre em camundongos é descrito. Esse método é baseado em relatos anteriores 5,6. As vantagens dessa técnica são que ela é simples, rápida e não requer equipamentos especializados, como uma armação estereotáxica. Como descrito a seguir, esse procedimento envolve a manipulação de uma seringa de vidro em relação a pontos na cabeça do camundongo para fazer as injeções, o que pode ser feito rapidamente e, portanto, requer apenas alguns minutos de anestesia gasosa no dia do experimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um meio simples e eficaz para fazer injeções de ICV em camundongos é descrito. Uma vez que esta técnica não requer uma estrutura estereotáxica, esta abordagem para a entrega central de drogas e agentes experimentais é acessível a mais pesquisadores. Além disso, essa abordagem é relativamente alta, uma vez que o procedimento de preparação e injeção pode ser realizado rapidamente.
Como esse procedimento requer a manipulação manual de agulhas e seringas de vidro utilizando d…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Dra. Kellie Breen Church, ao Sr. Michael Kreisman e à Sra. Jessica Jang por suas contribuições para a coleta dos dados mostrados nos resultados representativos. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
Referenzen
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