Intrazerebroventrikuläre Freihandinjektionen bei Mäusen
Summary
Hier wird ein einfacher und schneller Ansatz zur Durchführung von intrazerebroventrikulären Injektionen bei Mäusen unter Verwendung eines Freihandansatzes (d.h. ohne stereotaktische Vorrichtung) beschrieben.
Abstract
Die Untersuchung neuroendokriner Systeme erfordert oft die Verabreichung von Medikamenten, Viren oder anderen experimentellen Wirkstoffen direkt in das Gehirn von Mäusen. Eine intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion ermöglicht die großflächige Verabreichung des experimentellen Wirkstoffs im gesamten Gehirn (insbesondere in den Strukturen in der Nähe der Ventrikel). Hier werden Methoden zur Freihand-ICV-Injektion bei erwachsenen Mäusen beschrieben. Durch visuelle und taktile Landmarken auf den Köpfen von Mäusen können Injektionen in die Seitenventrikel schnell und zuverlässig durchgeführt werden. Die Injektionen werden mit einer Glasspritze durchgeführt, die in der Hand des Versuchsleiters gehalten und in ungefährem Abstand zu den Landmarken platziert wird. Somit benötigt diese Technik keinen stereotaktischen Rahmen. Darüber hinaus erfordert diese Technik nur eine kurze Isofluran-Anästhesie, die eine anschließende Beurteilung des Verhaltens und/oder der Physiologie von Mäusen bei wachen, sich frei verhaltenden Mäusen ermöglicht. Die Freihand-ICV-Injektion ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die effiziente Verabreichung experimenteller Wirkstoffe in das Gehirn lebender Mäuse und kann mit anderen Techniken wie häufigen Blutentnahmen, neuronalen Schaltkreismanipulationen oder In-vivo-Aufzeichnungen kombiniert werden, um neuroendokrine Prozesse zu untersuchen.
Introduction
Die Abgabe von experimentellen Wirkstoffen wie Medikamenten1, Viren2 oder Zellen3 an das Gehirn ist für die neuroendokrine Forschung oft notwendig. Wenn der Wirkstoff die Blut-Hirn-Schranke nicht ohne weiteres überwindet oder das experimentelle Ziel darin besteht, die zentralen Wirkungen des Wirkstoffs gezielt zu testen, ist es wichtig, eine zuverlässige Methode für die Verabreichung von Injektionen in das Gehirn zu haben. Darüber hinaus bietet die Injektion in den intrazerebroventrikulären Raum (ICV) die Möglichkeit, den Wirkstoff weit im Gehirn zu verteilen und bietet eine große Zielfläche, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Injektion erhöhtwird 2.
Eine gängige Methode zur Herstellung von ICV-Injektionen ist das Einsetzen einer permanenten Verweilkanüle. Bei diesem Ansatz ist ein stereotaktischer Rahmen notwendig, um die handelsübliche oder individuell angefertigte Kanüle zu positionieren, da die Kanüle geklebt oder zementiert wird. Oft wird nach der Genesung eine supraphysiologische Dosis Angiotensin II über die Kanüle verabreicht, und wenn das Trinkverhalten sofort beobachtet wird, gilt die Kanüle als korrekt platziert4. Dieser Ansatz hat viele Vorteile, darunter die Möglichkeit, eine Langzeitinfusion durchzuführen und dasselbe Tier mehrmals zu injizieren. Darüber hinaus kann bei Verwendung von Angiotensin II die korrekte Platzierung vor der Verabreichung von experimentellen Verbindungen bestätigt werden. Es gibt jedoch einige Einschränkungen bei der Platzierung einer permanenten Kanüle, einschließlich der Notwendigkeit einer teuren Ausrüstung (stereotaktischer Rahmen), der Möglichkeit einer Beschädigung der Kanüle nach dem Einsetzen (z. B. können Mäuse auf der Kanüle eines Käfiggefährten kauen) und der Möglichkeit von Infektionen um die permanente Kanüle herum. Einzelne ICV-Injektionen können unter Verwendung eines stereotaktischen Rahmens3 durchgeführt werden, der zwar wirksam ist, jedoch eine erhebliche Exposition gegenüber Anästhesie erfordert und daher einige akute physiologische und verhaltensbezogene Wirkungen der Behandlung verschleiern kann. Darüber hinaus erfordert die Platzierung von Mäusen in einem stereotaktischen Rahmen ein erhebliches Training, um eine stabile Platzierung zu erreichen und das Reißen der Gehörgänge zu verhindern.
Hier wird eine etablierte Methode zur Herstellung von Freihandinjektionen bei Mäusen beschrieben. Diese Methode basiert auf früheren Berichten 5,6. Die Vorteile dieser Technik sind, dass sie einfach und schnell ist und keine spezielle Ausrüstung wie einen stereotaktischen Rahmen erfordert. Wie unten beschrieben, beinhaltet dieses Verfahren die Manipulation einer Glasspritze in Bezug auf Landmarken auf dem Mauskopf, um die Injektionen durchzuführen, was schnell durchgeführt werden kann und daher nur wenige Minuten Gasanästhesie am Versuchstag erfordert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird ein einfaches und effektives Mittel zur Herstellung von ICV-Injektionen bei Mäusen beschrieben. Da diese Technik keinen stereotaktischen Rahmen benötigt, ist dieser Ansatz für die zentrale Verabreichung von Medikamenten und experimentellen Wirkstoffen für mehr Forscher zugänglich. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz einen relativ hohen Durchsatz, da das Präparations- und Injektionsverfahren schnell durchgeführt werden kann.
Da dieses Verfahren die Handhabung von Nadeln und ei…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Kellie Breen Church, Michael Kreisman und Jessica Jang für ihre Beiträge zur Erhebung der in den repräsentativen Ergebnissen gezeigten Daten. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.) unterstützt.
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
Referenzen
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
