Schweinemodell für Biofilminfektion und unsichtbare Wunden

Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) #21147 genehmigt wurden. Die Studie wurde am Laboratory Animal Resource Center (LARC) der Indiana University durchgeführt. Wir haben in diesem Protokoll ein weibliches weißes Hausschwein (70-80 lb) verwendet. 1. Akklimatisierung der Tiere Nach der Ankunft der Schweine in der Einrichtung sollten die Tiere mindestens 3 Tage lang einzeln im selben Raum untergebracht werden, um sich zu akklimatisieren und soziale Interaktion zu ermöglichen. Füttern Sie die Schweine mit einer ausgewogenen Ernährung. Entscheiden Sie die gefütterte Menge anhand des Gewichts und befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass das Tier vor dem Eingriff 6-12 Stunden nüchtern ist, um Übelkeit, Erbrechen und das Absaugen von Magenflüssigkeit während der Narkose zu verhindern. 2. Einrichtung des Operationssaals Bereiten Sie das Anästhesiegerät vor und stellen Sie sicher, dass es mit dem Atemkreislauf bereit ist. Richten Sie den Raum für die Operation ein, wie unten beschrieben (Abbildung 1A).Decken Sie den Behandlungstisch mit einem sterilen Tuch ab und legen Sie eine zirkulierende Wasserdecke darunter, um die Wärmeregulierung zu unterstützen. Stellen Sie einen Tisch mit Induktionsmaterial und Materialien zur Vorbereitung der Operation auf. Stellen Sie einen Tisch mit den Brennergeräten und Steuerkästen auf. Richten Sie das Bildgebungsgerät ein, und stellen Sie sicher, dass es eingeschaltet ist. 3. Sedierung des Schweins Das Schwein wird mit einer intramuskulären Injektion von TKX (Telazol 4,4 mg/kg; Ketamin 2,2 mg/kg; Xylazin 2,2 mg/kg) in einer Dosis von 1 ml/50 lb sediert. Halten Sie das Schwein im Behandlungsraum mit 1%-3% Isofluran, das über eine Maske verabreicht wird. Verabreichung der (präoperativen) Analgetika an die Schweine gemäß dem IACUC-Protokoll; einige Beispiele sind wie folgt: Buprenorphin 0,3 mg/ml, 0,01-0,05 mg/kg i.m.; Carprofen 50 mg/ml, 4 mg/kg i.m. oder SQ; Fentanyl transdermal 100 mcg/h auf die Ohrmuschel aufgetragen; Gabapentin 300 mg Kapseln, 3-10 mg/kg PO.HINWEIS: Bei allen Verbrennungs- und Biopsieverfahren wird 1 Dosis Gabapentin am Tag vor der Operation und 1 Dosis Carprofen am Tag des Eingriffs verabreicht. Für das Hauptverbrennungsverfahren wird ein Fentanyl-Pflaster platziert und während der chirurgischen Vorbereitung wird 1 volle Dosis Buprenorphin verabreicht. 4. Einleitung der Anästhesie Sterilisieren Sie das Ohr mindestens dreimal abwechselnd mit 2%igem Chlorhexidin-Peeling und Alkohol. A 22-18 G 1 in einem intravenösen Katheter in die marginale Ohrvene einführen und den Blutfluss bestätigen. Spülen Sie den Katheter mit Kochsalzlösung und fixieren Sie den Katheter mit chirurgischem Klebeband (Abbildung 1B). Intubieren Sie das Schwein mit einem entsprechend großen Endotrachealtubus (7-9 mm), sobald die Muskelentspannung durch Inhalation der Anästhesie über die Maske erreicht wurde. Kontrollieren Sie die Muskelentspannung durch einen Verlust des Kiefertonus und die Beobachtung eines Lidreflexes.Öffnen Sie das Röhrchen und testen Sie das Leck der Manschette mit einer Luftspritze. Führen Sie das Röhrchen mit Hilfe eines Laryngoskops30 ein. Blasen Sie die Manschette auf und befestigen Sie den Schlauch, sobald die richtige Platzierung bestätigt ist. Schließen Sie den Molch an den Rückatmungskreislauf an.HINWEIS: Das Rohr wird über die Schnauze gebunden und mit Rollgaze gesichert. Die Auskultation des Brustkorbs wird mit einem Stethoskop durchgeführt, um die korrekte Platzierung des Tubus zu bestätigen.HINWEIS: Während der Anästhesie wird alle 5-10 Minuten Luft zugeführt, indem das Pop-Off-Ventil geschlossen und der Atembeutel gedrückt wird, bis das Druckmanometer 20 mm/Hg erreicht, um eine Positionsatelektase zu verhindern. Überwachen Sie das Tier und die Narkosetiefe.Schließen Sie den Molch an einen Multiparameter-Monitor an. Der Monitor misst kontinuierlich die Sauerstoffsättigung (SpO 2), die Pulsfrequenz, das Kohlendioxid (EtCO2), die Atemfrequenz und die Temperatur. Zeichnen Sie die Vitalwerte während des gesamten Eingriffs alle 10 Minuten auf. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Schmerzreflexe mit einem Kneifen der Zehen im Hinterbein testen, bevor Sie mit der Verwundung beginnen.HINWEIS: Stellen Sie bei Bedarf den Anästhesie-Verdampfer ein, um eine zusätzliche Anästhesie zu verabreichen, oder warten Sie einige Minuten. Kontrollieren Sie die Schmerzreflexe und Lidreflexe während der gesamten Operation regelmäßig. 5. Tierische Vorbereitung für Brandwunden Trennen Sie das Schwein vom Anästhesiegerät und legen Sie es auf den Behandlungstisch. Bringen Sie den Molch in die Brustbein-Liegeposition und stellen Sie sicher, dass alle angeschlossenen Leitungen und Schläuche gesichert sind (Abbildung 1C). Schließen Sie das Schwein wieder an das Anästhesiegerät an und halten Sie denO2-Wert bis zum Ende des Eingriffs bei 0,8-1,5 l/min und den Isofluran bei 1%-3%. Verabreichen Sie dem Schwein intravenöse Flüssigkeiten (LRS) mit einer Tropfrate von 8-10 ml/kg/h. Überwachen Sie die Anästhesie wie in Schritt 4.3 beschrieben. 6. Antiseptische Vorbereitung und Markierung der Hautverbrennungsstelle Bereiten Sie den Wundbereich vor, indem Sie sich rasieren und die Haarentfernungscreme auftragen, wie unten beschrieben (Abbildung 2).Rasieren Sie den Schweinerücken in einem ca. 25 cm breiten Bereich von der Wirbelsäule bis zur Achselhöhle beidseitig mit einer elektrischen Haarschneidemaschine. Tragen Sie die Haarentfernungscreme auf die abgeschnittene Stelle auf und lassen Sie sie 3-7 Minuten einwirken. Entfernen Sie die Creme zusammen mit den Haaren mit sauberen, saugfähigen Handtüchern. Vorbereitung der BrandstelleSchrubben Sie die zu verwundende Stelle mindestens dreimal ca. 5 Minuten lang abwechselnd mit 2 % Chlorhexidin-Peeling und 70 % Isopropylalkohol. Stellen Sie sicher, dass das Peeling in einem Bullseye-Muster (beginnend in der Mitte und spiralförmig nach außen) vom Personal mit sterilen Handschuhen aufgetragen wird. Markieren Sie die Wundstellen mit einer sterilen Verbrennungsschablone und einem chirurgischen Hautmarker (Abbildung 2B). Markieren Sie sechs bis acht Wunden (2 Zoll x 2 Zoll) symmetrisch auf dem Rücken. Decken Sie die Bereiche um die markierten Stellen mit einem sterilen Tuch ab, um eine Kontamination zu reduzieren (Abbildung 2C). 7. Verfahren zur Verwundung von Verbrennungen Verwenden Sie ein Brenngerät, z. B. einen eigens hergestellten Brenner, der aus einem 2 Zoll x 2 Zoll großen Edelstahlblock (Gewicht: 352 g) besteht, der mit einem Metallstift, einem elektronischen Mikrostat und einer elektronischen Waage (Gesamtgewicht: 1.714 g; Abbildung 3).Stellen Sie den Brenner auf die gewünschte Temperatur ein. Stellen Sie die Zieltemperatur für Wunden in voller Dicke auf 150 °C ein (Abbildung 3A). Stellen Sie dazu den Sollwert (SP) am Steuergerät auf 150 °C ein. Stellen Sie den unteren Sollwert auf 145 °C und den oberen Sollwert auf 155 °C ein (Abbildung 1D). Erzeugen Sie eine Brandwunde mit voller Dicke von 2 Zoll x 2 Zoll, indem Sie erhitzte Edelstahlblöcke verwenden, die mit dem Brenngerät verbunden sind, und diese 60 s lang auf die Haut legen (Abbildung 3B, C). Verwenden Sie während des Auftragens der Verbrennung die elektronische Waage, um sicherzustellen, dass der Brenner einen gleichmäßigen Druck ausübt. 8. Beurteilung und Bildgebung von Brandwunden Digitale FotografieFotografieren Sie die Wunden mit einer DSLR-Kamera und einem 17-55-mm-Ultraschall-Weitwinkelobjektiv mit Elektrofokus und einer Taschenlampe. Machen Sie ein digitales Foto des gesamten Schweinerückens, einschließlich eines Plakats mit der Schweineidentifikation, dem Zeitpunkt und dem Datum. Nehmen Sie dann Bilder für jede Wunde separat auf, auf denen ein Plakat mit der Schweine-ID, der Wund-ID und dem Zeitpunkt sowie ein Lineal zu sehen ist. Berechnen Sie die Wundfläche als Prozentsatz der ursprünglichen Wundgröße zu jedem Zeitpunkt der Entnahme bis Tag 56.ANMERKUNG: In dieser Arbeit wurde die Wundfläche zu jedem Zeitpunkt (d0, d7, d14, d28 und d56) als Prozentsatz der ursprünglichen Wundfläche auf d0 berechnet. Laser-Speckle-Bildgebung (LSI)Verwenden Sie für die Laser-Speckle-Bildgebung einen Blutperfusions-Imager, der auf der Laser-Speckle-Kontrast-Analyse (LASCA)-Technologie basiert, um die mikrovaskuläre Wundperfusion in Echtzeit zu beurteilen. Nehmen Sie die Bilder aller Wunden in einer einzigen Aufnahme auf. Stellen Sie den Messwert des Arbeitsabstands von der Laserkamera zur Wunde so ein, dass er für die Bildgebung jeder Wunde konsistent ist (Abbildung 4A). Erfassen Sie die Perfusion durch eine Reihe von Bildern, die über einen Zeitraum von 10-15 s aufgenommen wurden. Nachdem eine Wunde aufgenommen wurde, wird die Aufzeichnung automatisch angehalten, und die Aufzeichnung wird fortgesetzt, sobald die Kamera auf die nachfolgende Wunde eingestellt ist. Jedes Mal, wenn die Aufzeichnung unterbrochen wird, wird eine Markierung hinzugefügt, um die Wunde zu identifizieren. Transepidermaler Wasserverlust (TEWL)Messen Sie den TEWL für jede Wunde mit einem Standardgerät, einer TEWL-Sonde und einer Software (Abbildung 4B). Legen Sie für jede Wunde eine saubere Sondenabdeckung über die Sondenspitze, die mit dem Wundgewebe in Kontakt kommt. Legen Sie die Sonde vorsichtig und gleichmäßig auf die Haut und starten Sie die Messung, indem Sie die Start-Taste am Gerät drücken. Messen Sie jede Wunde fünfmal, zuerst in der Mitte und dann an jeder Ecke. Exportieren Sie dann alle Messwerte in eine Tabelle (Abbildung 4B). Harmonischer Ultraschall (HUSD)Führen Sie eine HUSD-Kartierung durch, indem Sie die Wunde mit einer Ultraschallsonde (US-Sonde) von der Mittellinie (Wirbelsäule) aus in Richtung der seitlichen Seite des Schweins scannen, wo sich wieder normale Haut befindet. Befolgen Sie dieses Scanmuster für jede Wunde sowohl im B-Modus als auch im Gewebeelastographie-Modus mit dem Ultraschallgerät (Abbildung 4C).Tragen Sie für das B-Mode-Scannen steriles Ultraschallgel auf den Wundbereich auf und tragen Sie etwas davon auf die hochauflösende Sonde ML-615 auf. Versehen Sie jede Aufnahme mit dem Etikett zur Wundidentifikation. Starten Sie die Aufzeichnung und bewegen Sie die Sonde langsam von der Mittellinie entlang der Wunde, bis die normale Haut auf der anderen Seite erreicht ist.HINWEIS: Nach Beendigung des Scanvorgangs wird die Aufzeichnung gespeichert und zur Analyse aus dem Gerät exportiert. Für die Elastographie schalten Sie das Ultraschallgerät in den Elasto-Modus, indem Sie die Elasto-Taste drücken. Scannen Sie die Wunde erneut auf die gleiche Weise wie beim B-Modus-Scannen und stellen Sie sicher, dass der gleichmäßige Druck der Sonde aufrechterhalten wird, damit der Elastographie-Farbindikator (grüne Balken) während der gesamten Aufnahme sichtbar bleibt.HINWEIS: Der geeignete Druck kann durch die Skalenleiste auf der Aufzeichnung bestimmt werden, die grün erscheint, wenn der richtige Kontakt hergestellt wird (Abbildung 4D). Ändern Sie die Anmerkung, nachdem jede Wunde sowohl im B-Modus als auch im Elasto-Modus (zwei Aufzeichnungen pro Wunde) abgebildet wurde. Ändern Sie den Kommentar in der Software so, dass er die Informationen für die nächste Wunde enthält, und wiederholen Sie den Vorgang für die nachfolgenden Wunden. 9. Verband und Verband Decken Sie die Brandwunden einzeln mit transparenten Folienverbänden oder dem Testverband ab (Abbildung 5A, B). Legen Sie einen größeren transparenten Folienverband über die gesamte Wundfläche (Abbildung 5C). Tragen Sie eine zweite Schicht Rollgaze locker um den gesamten Rumpf des Schweins auf, um das flüssige Exsudat aus den Wunden aufzusaugen. Rollen Sie das Schwein von der Seite bis leicht auf dem Rücken hin und her, um das Verbandsmaterial um das Schwein zu wickeln. Decken Sie die Gaze locker mit einer Schicht flexibler elastischer Binde ab (Abbildung 5D). Achten Sie darauf, dass der Verband nicht zu eng sitzt, da ein zu festes Anlegen die Atmung einschränken und Druck auf den Bauch ausüben kann, was zu einem Rektumprolaps oder verschiedenen Komplikationen führen kann.HINWEIS: Die elastische Binde ist dehnbar und kann während der Anwendung leicht zu fest angezogen werden. Ziehen Sie es von der Rolle und lassen Sie es über den Rand des vorherigen Wickels legen, um ein zu starkes Anziehen zu verhindern. Decken Sie den elastischen Verband mit einer letzten Schicht von 4 Stück elastischem Band ab (Abbildung 4E). Achten Sie auch hier darauf, dass die Anwendung nicht zu eng ist, aber stellen Sie sicher, dass der Verband am oberen und unteren Rand befestigt ist, um zu verhindern, dass er herunterrutscht, wenn sich das Schwein nach dem Eingriff bewegt. 10. Genesung und Nachsorge des Tieres GenesungBeenden Sie das Anästhesiegas nach Abschluss der Verwundung, des bildgebenden Verfahrens und des Verbandes. Lassen Sie das Schwein mindestens 5 Minuten lang mit Sauerstoff versorgt werden. Bringen Sie das Schwein nach der Rückkehr in das Hauptgehege vom Transport-/Hubtisch auf eine Schaumstoffrückgewinnungsmatte im Käfig. Heben Sie die automatische Tränke an und entfernen Sie den J-Feeder, um Verletzungen des Schweins während der Erholung zu vermeiden. Decken Sie das Schwein mit Decken (einschließlich einer Warmluftdecke) ab, wenn eine Unterkühlung vorliegt. Überwachen und zeichnen Sie alle 10-15 Minuten die Vitalwerte einschließlich Temperatur, Puls, Atemfrequenz und SpO2 auf. Überwachen Sie das Schwein kontinuierlich, bis es in der Lage ist, das Brustbein selbstständig aufrechtzuerhalten. Sobald sich das Schwein vollständig erholt hat, senken Sie die Nippeltränke ab, und dann kann auch das Schwein gefüttert werden. Beurteilung der SchmerzenFühren Sie eine postoperative Schmerzbeurteilung mit einem modifizierten Glasgow-Schmerzbewertungsformular durch. Stellen Sie sicher, dass die Schmerzbeurteilungen in den ersten 3-4 Tagen nach der Operation mindestens alle 12 Stunden von Labor- oder LARC-Mitarbeitern durchgeführt werden. Die Häufigkeit der Schmerzbewertung wird vom behandelnden Tierarzt festgelegt. Wenn der Wert des Tieres über 5 liegt, ist eine Notfallanalgesie (Buprenorphin oder Hydromorphon) zu verabreichen. Analgesie durch Verabreichung einer Dosis Buprenorphin 0,01-0,05 mg/kg i.m. vor dem Eingriff, wobei eine zweite Dosis 8-12 Stunden später verabreicht wird. Legen Sie ein Fentanyl-Pflaster (100 μg/h) vor der Brandwunde auf die Ohrmuschel. Injizieren Sie Carprofen 4 mg/kg i.m. oder SQ vor dem Eingriff und dann einmal täglich IM, SQ oder PO für 2 Tage oder nach Anweisung des LARC-Tierarztes. Verabreichen Sie Gabapentin 3-10 mg/kg oral, wobei eine Dosis am Tag vor dem Eingriff, am Morgen des Eingriffs, am Abend nach dem Eingriff und dann alle 12 Stunden für 3-5 Tage verabreicht wird. DiätStellen Sie sicher, dass sich die Schweine erholen, und gewähren Sie dann zweimal täglich freien Zugang zu Wasser und Futter entsprechend ihrer gewichtsabhängigen Ration. Sorgen Sie für eine Anreicherung der Lebensmittel (frisches Obst und Gemüse, gefrorenes Obst, Marshmallows, Joghurt, Pudding usw.) und verwenden Sie diese, um zum Essen zu verleiten, wenn ein verminderter Appetit beobachtet wird. VerbandswechselWechseln Sie die Verbände mindestens einmal wöchentlich oder öfter, wenn die Verbände verschmutzt sind oder um Behandlungsstrategien zu berücksichtigen. Wechseln Sie die Verbände nach der Bildgebung noch unter Narkose oder sedieren Sie das Schwein nur mit TKX für einen Verbandswechsel. Um den Verband zu ersetzen, entfernen Sie den verschmutzten Verband zunächst vorsichtig mit einer Lister-Verbandschere oder einer Traumaschere, wobei Sie darauf achten sollten, dass die Außenseite des Verbandes nicht mit den Wunden in Berührung kommt. Reinigen Sie den Bereich um die Wunden bei Bedarf mit 0,9 % NaCl auf sauberer Gaze und trocknen Sie den Bereich vorsichtig ab. Befolgen Sie die in Abschnitt 9 beschriebenen Schritte zum Verbinden von Verbänden.HINWEIS: Wenn experimentelle Verbände angelegt werden, können diese vor dem Abdecken der Wunden mit dem transparenten Filmverband angelegt werden. Häufigkeit der BildgebungErhalten Sie Bildgebung (Digitalfotos, LSI, TEWL und HUSD) zu verschiedenen Zeitpunkten während der Studie. Sammeln Sie Bildgebungsdaten an Tag −3 (Brandwunde), Tag 0 (Impfung) und Tag 7, Tag 14, Tag 28, Tag 35 und Tag 56 nach der Impfung. 11. Biofilmpräparation und -impfung Inokulum-PräparatBereiten Sie eine Starterplatte aus einem Glycerin-Gefrierschrank von Pseudomonas aeruginosa (PA01) für eine Reinkultur des Bakteriums vor. Züchten Sie eine P. aeruginosa-Kultur in salzarmem Luria-Bertani-Agar (LBA) und inkubieren Sie sie bei 37 °C über Nacht. Am nächsten Tag werden 5 ml salzarme Luria-Bertani-Bouillon (LBB) mit einer einzelnen P. aeruginosa-Kolonie geimpft und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 200 U/min inkubiert. Um Log-Phase-Zellen zu erhalten, werden 200 μl der Übernachtkultur in 5 ml LBB inokuliert und im Schüttler bei 200 U/min bei 37 °C für 2,5 h inkubiert. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer. Bereiten Sie serielle Verdünnungen bis zu 1 x 10−9 unter Verwendung von 100 μl aus der Kultur in 900 μl sterilem LBB vor.ANMERKUNG: Wir begannen mit unverdünnten Proben und endeten mit 1 x 10 7 KBE/ml.Wir erhielten zählbare Kolonien in der 1 x 107-Verdünnung, so dass wir diese Verdünnung als Endverdünnung betrachteten. 100 μl jeder Verdünnung auf LBA verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren. Verwenden Sie gemäß den mikrobiologischen Standardprotokollen Verdünnungen, die zählbare Kolonien (30-300) für die Koloniezählung zeigen, und erhalten Sie die koloniebildenden Einheiten (KBE). Inokulation der Wunde200 μl aus der Übernachtkultur in 5 ml LB-Brühe intubiert und im Schüttler bei 37 °C für 2,5 h inkubiert. Messen Sie die optische Dichte der Tageskultur bei 600 nm (OD600). Für die PA01-Inokulation sind 3 x 10 8 KBE/ml zu verwenden (250 μl von 1 x 108 KBE/ml PA01 werden pro Wunde geimpft). Transportieren Sie das Inokulum in einem Biohazard-Behälter zur Tierstation. Verteilen Sie das Inokulum am Tag 3 nach der Verbrennung mit einer Pipette auf der Oberfläche der exponierten Wunden und verteilen Sie es gleichmäßig mit einem Einwegstreuer (Abbildung 6). Halten Sie die Wunden ca. 15 Minuten lang offen, bevor Sie sie verbinden.HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe, Impfungen, Gewebebiopsien, Bildgebung und Verbände werden unter Vollnarkose durchgeführt, wie in den Abschnitten 3 und 4 beschrieben. Bestätigung der Etablierung einer InfektionHINWEIS: Um zu bestätigen, dass sich die Wunden nach der Inokulation erfolgreich infiziert haben, werden verschiedene Ansätze verwendet und Wundproben mit Proben von normaler Haut verglichen. Im Folgenden finden Sie einige Beispiele.Für die pathologiebasierte Analyse von Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen wurden, wird die Anzahl der koloniebildenden Einheiten verwendet, um eine Infektion (KBE; Abbildung 7E, F).Entnehmen Sie 6 mm Wundgewebe durch Stanzbiopsie. Etikettieren und wiegen Sie leere 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden. Übertragen Sie die Proben in die Röhrchen und wiegen Sie die Röhrchen mit den Proben. Würfeln Sie das Gewebe mit einem Skalpell auf einer sterilen Oberfläche. Führen Sie alle Schritte in einer BSL2-Haube durch.HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das Gewebe leicht homogenisiert werden kann, sollte die Größe sehr klein sein (aber nicht weniger als 0,5 mm) Geben Sie die Probe in das Röhrchen und fügen Sie 1 ml PBS hinzu. Mischen und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Hartgewebsschleifsonde. Das Homogenat wird seriell (unverdünnt auf 1 x 10−5) verdünnt und 50 μl jeder Verdünnung in selektiven (Pseudomonas Isolation Agar, PIA) und nichtselektiven (LBA) Medien aufgetragen. Alle Verdünnungen werden unter aeroben Bedingungen bei 37 °C für 18-24 Stunden inkubiert. Stellen Sie die Platten mit den richtigen Lichtverhältnissen ab. Wählen Sie Platten mit 30-300 Kolonien aus, wenn keine der Platten diese Konzentration erreicht hat, verwenden Sie die unverdünnte Platte. Verwenden Sie BildJ, um die Anzahl der Kolonien zu zählen, und berechnen Sie die KBE pro Platte, indem Sie den Durchschnittswert mit dem endgültigen Verdünnungsfaktor multiplizieren. Erfassen Sie die Bilder von Proben, die am Tag 7 nach der Inokulation und zu anderen Zeitpunkten entnommen wurden, mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM), um das Vorhandensein der bakteriellen Biofilme zu bestätigen (Abbildung 7G).ANMERKUNG: Tag 7 nach der Inokulation wurde gewählt, weil es der Tag der Etablierung der Biofilminfektion und des Beginns der Erweichung des Verbrennungsschorfes ist, was das Eindringen der US-Wellen und damit die Visualisierung des tieferen Gewebes ermöglicht. Sehen Sie sich in Abbildung 4 das Bild der Brandwunde von Tag 3 in den USA an, das den dicken, ledrigen Schorf zeigt, der verhindert, dass die US-Wellen in das tiefere Gewebe eindringen. Die Schnitte der Wundbiopsien werden mit spezifischen Antikörpern gegen P. aeruginosa gefärbt, um das Vorhandensein der spezifischen Bakterien zu bestätigen, wie in einer früheren Veröffentlichung13 gezeigt (Abbildung 7H). Führen Sie Next-Generation-Sequencing (NGS) durch, wie in Sinha et al.31 veröffentlicht. Quantifizieren Sie die bakterielle 16srRNA aus den infizierten Wunden und den normalen, nicht infizierten Hautproben, die zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen wurden, beginnend am Tag 7 nach der Inokulation bis zum Ende der Studie. 12. Entnahme von Biopsien Entnehmen Sie die Gewebebiopsien zur Analyse nach der Bildgebung an Tag 7, Tag 14, Tag 28 und Tag 56 nach der Impfung. Entnehmen Sie Biopsien aus jeder Wunde nur einmal, um die Störung des Heilungsprozesses zu minimieren.HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe, Impfungen, Gewebebiopsien, Bildgebung und Verbände werden unter Vollnarkose durchgeführt, wie in den Abschnitten 3 und 4 beschrieben.Infiltrieren Sie den Bereich um die Wunde mit 0,5% Bupivacain. Schneiden Sie mit einem Einwegskalpell mit einer Klinge der Größe 10 einen 3-4 mm breiten Streifen von einem Rand der Wunde zum anderen, wobei Sie auf beiden Seiten kleine Ränder normaler Haut beibehalten. Legen Sie den Streifen zur Fixierung in ein beschriftetes konisches Röhrchen, das mit 4% gepuffertem Formalin gefüllt ist.HINWEIS: Bei frühen Bildgebungs- und Biopsieverfahren wird während der chirurgischen Vorbereitung eine volle Dosis Buprenorphin verabreicht. Bei späten Biopsieverfahren wird während der chirurgischen Vorbereitung eine halbe Dosis Buprenorphin verabreicht. Nach allen Verbrennungen und Biopsieverfahren wird Gabapentin nach Anweisung des behandelnden Tierarztes bis zu 7 Tage lang BID verabreicht. Carprofen wird tagelang nach der Operation oder nach Anweisung des behandelnden Tierarztes verabreicht. Schneiden Sie eine 6-mm-Stanzbiopsie aus der Wunde (entweder vom Wundbett oder vom Wundrand). Entnehmen Sie vom Wundrand, einschließlich eines Teils der normalen Haut und des Wundbetts, für verschiedene Arten von Analysen. Entnehmen Sie die Probe mit einer sterilisierten Pinzette und einer Präparierschere. Geben Sie die Biopsieprobe zur Verarbeitung und Analyse in das entsprechende Röhrchen oder die entsprechende Kassette. Für CFU, REM, RNA und FPPE werden die Proben in Röhrchen mit einem geeigneten Puffer aufbewahrt. Zum Beispiel können Proben in Kassetten für die Lasereinfangmikroskopie (LCM) und Immunhistochemie (IHC) in OCT gegeben werden. Erreichen Sie die Hämostase nach der Entnahme der Proben, indem Sie die Wunde vorsichtig mit einer sterilen Gaze drücken. Decken Sie die Wunde mit einem nicht haftenden Verband ab und verbinden Sie sie wie in Abschnitt 9 beschrieben. 13. Euthanasie und Gewebeentnahme Betäuben Sie das Schwein am Tag der Euthanasie mit TKX und betäuben Sie es mit Isofluran. Legen Sie einen intravenösen Katheter in die marginale Ohrvene, indem Sie die in Abschnitt 3 beschriebenen Schritte befolgen. Intubieren Sie das Schwein gemäß den Schritten in Abschnitt 4. Entfernen Sie den Verband, sobald das Schwein betäubt ist, und reinigen Sie den Bereich um die Wunden. Vollständige digitale Fotografie, LSI-, TEWL- und HUSD-Bildgebung. Entnehmen Sie die Proben aus den Wunden und der normalen Haut, indem Sie die in Abschnitt 12 beschriebenen Schritte befolgen. Sobald alle erforderlichen Proben entnommen sind, wird das Schwein noch unter Narkose durch eine intravenöse Injektion einer handelsüblichen Euthanasielösung (Natrium-Pentobarbital) auf humane Weise eingeschläfert. Verwenden Sie ein Stethoskop zur Auskultation, um den Stillstand des Herzschlags und die spontane Atmung zu bestätigen. Führen Sie eine sekundäre Euthanasiemethode durch, wie sie von SOM IACUC gefordert wird, indem Sie ein Skalpell verwenden, um einen Pneumothorax zu induzieren. Den Schweinekadaver in ein Fass umfüllen und zum Gefrierschrank transportieren, wo er zur Verbrennung abgeholt wird.