猪生物膜感染和隐形伤口模型

所有动物研究均按照机构动物护理和使用委员会 （IACUC） #21147 批准的方案进行。该研究是在印第安纳大学实验动物资源中心（LARC）进行的。我们在本协议中使用了一头雌性家养白猪（70-80磅）。 1. 动物驯化 猪到达设施后，将动物单独饲养在同一房间内至少 3 天，以便适应环境和社交互动。 给猪喂均衡的饲料。根据重量确定喂食量，并遵循制造商的建议。 确保动物在手术前禁食 6-12 小时，以防止在麻醉下恶心、呕吐和吸入胃液。 2. 手术室布置 准备麻醉机，并确保它已准备好再呼吸回路。 如下所述安排手术室（图1A）。用无菌窗帘盖住手术台，并在下面放置循环水毯以帮助调节体温。 摆放一张桌子，上面摆放着诱导用品和手术准备材料。用燃烧器装置和控制箱设置一张桌子。设置成像设备，并确保其已打开。 3.猪的镇静 肌内注射TKX（Telazol 4.4 mg/kg;氯胺酮2.2 mg/kg;甲苯噻嗪2.2 mg/kg），剂量为1mL/50 lb，镇静猪。在手术室中通过面 罩输送1 %-3%异氟醚。 根据IACUC方案给猪施用（术前）镇痛药;一些例子如下：丁丙诺啡0.3mg/mL，0.01-0.05mg/kg肌注;卡洛芬 50 mg/mL，4 mg/kg 肌注或 SQ;芬太尼透皮 100 mcg/h 放置在耳廓上;加巴喷丁 300 mg 胶囊，3-10 mg/kg PO。注意：对于所有烧伤和活检程序，将在手术前一天给予 1 剂加巴喷丁，在手术当天给予 1 剂卡洛芬。对于主要燃烧程序，将放置芬太尼贴片，并在手术准备期间给予 1 次全剂量丁丙诺啡。 4.麻醉诱导 用交替的 2% 氯己定磨砂膏和酒精对耳朵进行消毒至少 3 次。将静脉导管中的A 22-18 G 1插入边缘耳静脉，并确认血流。用生理盐水冲洗导管，并用手术胶带固定导管（图1B）。 一旦 通过 面罩吸入麻醉实现肌肉松弛，就用适当大小的气管插管（7-9毫米）给猪插管。通过观察到下颌张力的丧失和睑反射来检查肌肉松弛。打开管子，使用空气注射器测试袖带泄漏。借助喉镜30 插入管子。 给袖带充气，并在确认正确放置后固定管子。将清管器连接到再呼吸回路。注意： 将管子绑在鼻子上，并使用卷纱布将其固定。用听诊器对胸部进行听诊，以确认管子的正确放置。注意： 在麻醉期间，每 5-10 分钟通过关闭弹出阀并按下再呼吸袋供气一次，直到压力计达到 20 mm/Hg，以防止位置性肺不张。 监测动物和麻醉深度。将清管器连接到多参数监视器。监护仪将连续读取血氧饱和度 （SpO 2）、脉搏率、呼气末二氧化碳 （EtCO2）、呼吸频率和体温。在整个手术过程中每 10 分钟记录一次生命体征。 在开始伤口之前，通过捏后腿脚趾测试疼痛反射来评估麻醉深度。注意： 必要时，调整麻醉剂蒸发器以进行额外的麻醉，或等待几分钟。在整个手术过程中定期检查疼痛反射和睑反射。 5. 烧伤的动物准备 断开猪与麻醉机的连接，并将其移至手术台。将清管器置于胸骨卧位，并确保固定所有连接的管路和管子（图1C）。 将猪重新连接到麻醉机，并将O2 保持在0.8-1.5L / min，将异氟烷保持在1%-3%，直到手术结束。 以 8-10 mL/kg/h 的滴速向猪施用静脉输液 （LRS）。如步骤4.3所示监测麻醉。 6.皮肤烧伤部位的防腐剂和标记 如下所述，通过剃须和涂抹脱毛膏来准备伤口区域（图2）。使用电动剪从脊柱一直到两侧腋窝约25厘米宽的区域内剃除猪背。 将脱毛膏涂抹在剪裁的区域，静置 3-7 分钟。使用干净的吸水毛巾将乳霜和头发一起去除。 烧伤部位的准备用交替的2%氯己定擦洗膏和70%异丙醇擦洗要受伤的区域至少三次，持续约5分钟。确保由戴着无菌手套的人员以靶心模式（从中心开始，以螺旋状向外移动）涂抹磨砂膏。 使用无菌烧伤模板和手术皮肤标记标记伤口部位（图2B）。在背部对称地标记 6 到 8 个伤口（2 英寸 x 2 英寸）。 用无菌窗帘覆盖标记部位周围的区域以减少污染（图2C）。 7. 烧伤程序 使用燃烧装置，例如内部制造的定制燃烧器，该燃烧器由连接到金属手写笔的 2 英寸 x 2 英寸不锈钢块（重量：352 克）、电子微量器和电子秤（总重量：1,714 克; 图3）。将燃烧器设置为所需温度。在150°C下调整全层伤口的目标温度（图3A）。为此，请将控制单元上的设定点 （SP） 调整为 150 °C。 将低设定点设置为145°C，将高设定点设置为155°C（图1D）。 通过使用连接到烧伤装置的加热不锈钢块并将它们放在皮肤上 60 秒，创建 2 英寸 x 2 英寸的全层烧伤伤口（图 3B、C）。在燃烧过程中，使用电子秤确保燃烧器施加均匀的压力。 8. 烧伤创面评估和影像学检查 数码摄影使用数码单反相机和电焦短焦距 （EFS）、17-55 毫米超声波广角镜头和手电筒对伤口进行成像。 拍一张整头猪的数码照片，包括一张标有猪标识、时间点和日期的标语牌。然后，为每个伤口分别拍摄图像，显示带有猪 ID、伤口 ID 和时间点以及尺子的标语牌。 计算伤口面积作为每个收集时间点原始伤口大小的百分比，直到第 56 天。注：在这项工作中，每个时间点（d0、d7、d14、d28 和 d56）的伤口面积计算为 d0 上原始伤口面积的百分比。 激光散斑成像 （LSI）对于激光散斑成像，使用基于激光散斑对比分析（LASCA）技术的血液灌注成像仪来实时评估伤口微血管灌注。 在一次记录中拍摄所有伤口的图像。调整从激光相机到伤口的工作距离的测量值，使其与每个伤口的成像一致（图4A）。 通过在 10-15 秒内拍摄的一系列图像记录灌注。对伤口进行成像后，记录会自动暂停，一旦相机针对后续伤口进行调整，记录就会恢复。每次录制暂停时，都会添加一个标记来识别伤口。 经表皮失水 （TEWL）使用标准装置，TEWL探头和软件测量每个伤口的TEWL（图4B）。对于每个伤口，在探头尖端上放置一个干净的探头盖，探头尖端将与伤口组织接触。 将探头轻轻均匀地放在皮肤上，然后按设备上的开始按钮 开始 读数。 测量每个伤口五次，首先在中心，然后在每个角落。然后，将所有读数导出到电子表格（图4B）。 谐波超声 （HUSD）通过用超声（US）探针从中线（脊柱）扫描伤口来执行HUSD映射，从正常皮肤开始，到猪的外侧，再次出现正常皮肤。使用超声机在B模式和组织弹性成像模式下对每个伤口进行扫描模式（图4C）。对于 B 模式扫描，将无菌超声凝胶涂抹在伤口区域，并在 ML-615 高分辨率探头上涂抹一些。用伤口识别标签对每个记录进行注释。开始记录，然后将探头从伤口中线缓慢向下移动，直到到达另一侧的正常皮肤。注意： 完成扫描后，记录将被保存并从本机导出以供分析。 对于弹性成像，按下 Elasto 按钮将超声机切换到弹性波模式。以与B模式扫描相同的方式再次扫描伤口，确保探头保持均匀的压力，以使弹性成像颜色指示剂（绿色条）在整个记录过程中保持可见。注意： 适当的压力可以通过记录上的比例尺确定，当进行正确的接触时，比例尺显示为绿色（图 4D）。 在 B 模式和弹性模式（每个伤口两次记录）下对每个伤口进行成像后更改注释。更改软件中的注释以包含下一个伤口的信息，然后对后续伤口重复该过程。 9.包扎和敷料 用透明薄膜敷料或测试敷料单独覆盖烧伤伤口（图5A，B）。在整个伤口区域放置较大的透明薄膜敷料（图5C）。 在猪的整个躯干周围松散地涂上第二层卷纱布，以吸收来自伤口的任何液体渗出物。将猪从侧面来回滚动，稍微向后滚动，将绷带材料包裹在猪身上。 用一层柔性弹性绷带松散地覆盖纱布（图5D）。确保绷带不要太紧，因为绷带贴得太紧会限制呼吸并对腹部施加压力，从而导致直肠脱垂或其他并发症。注意： 弹性绷带具有弹性，在使用过程中很容易过度收紧。将其从卷筒上拉下并让它放在前一个包裹的边缘上有助于防止过度拧紧。 用松紧带中的最后一层4覆盖弹性绷带（图4E）。同样，确保敷料不要太紧，但要确保敷料固定在顶部和底部边缘，以防止它在手术后猪四处走动时滑落。 10. 动物恢复和术后护理 恢复完成伤口、成像程序和包扎后停止使用麻醉气体。让猪保持氧气至少5分钟。 返回主围栏后，将清管器从运输/升降台移至笼子中的泡沫回收垫上。抬起自动饮水器，并取下 j 型喂食器，以防止在恢复过程中对猪造成伤害。 如果存在体温过低，用毯子（包括暖风毯）盖住猪。每 10-15 分钟监测和记录一次生命体征，包括体温、脉搏、呼吸频率和 SpO2 。 持续监测猪，直到它能够独立保持胸骨卧位。一旦猪完全恢复，放下饮水器，然后也可以喂猪。 疼痛评估使用改良的格拉斯哥疼痛评分表进行术后疼痛评估。确保在术后的前 3-4 天内，实验室或 LARC 工作人员至少每 12 小时完成一次疼痛评估。疼痛评分的频率由主治兽医决定。如果动物得分高于 5，则给予抢救镇痛（丁丙诺啡或氢吗啡酮）。 通过在术前给予一定剂量的丁丙诺啡 0.01-0.05 mg/kg 肌注来提供镇痛，并在 8-12 小时后给予第二剂。 在烧伤前将芬太尼贴片（100 mcg/h）放在耳廓上。 术前注射卡洛芬 4 mg/kg IM 或 SQ，然后每天一次 IM、SQ 或 PO，持续 2 天或按照 LARC 兽医的指示。 口服加巴喷丁 3-10 mg/kg，剂量在手术前一天、手术当天早上、手术后晚上给药，然后每 12 小时给药一次，持续 3-5 天。 节食确保猪被恢复，然后根据其基于体重的日粮每天两次免费获得水和食物。 提供丰富的食物（新鲜水果和蔬菜、冷冻水果、棉花糖、酸奶、布丁等），如果观察到食欲下降，则用这些来诱食。 换药每周至少更换一次绷带，如果绷带变脏或适应治疗策略，则更频繁地更换绷带。 在麻醉下成像后更换绷带，或仅用TKX镇静猪以更换敷料。 要更换绷带，首先要用李斯特绷带剪刀或创伤剪小心地去除弄脏的绷带，注意不要让敷料的外部与伤口接触。 如果需要，在干净的纱布上使用 0.9% NaCl 清洁伤口周围的区域，然后轻轻擦干该区域。按照第 9 节中概述的包扎程序步骤进行操作。注意：如果正在使用实验性敷料，则可以在用透明薄膜敷料覆盖伤口之前使用这些敷料。 成像频率在整个研究的不同时间点获得成像（数码照片、LSI、TEWL 和 HUSD）。收集接种后第 -3 天（烧伤）、第 0 天（接种）和第 7 天、第 14 天、第 28 天、第 35 天和第 56 天的影像学数据。 11. 生物膜制备和接种 接种物制备从 铜绿假单胞菌 （PA01）的甘油冷冻原液中制备起始板，用于细菌的纯培养。在低盐Luria-Bertani琼脂（LBA）中培养 铜绿假单胞菌 培养物，并在37°C下孵育过夜。 第二天用单个 铜绿假单胞 菌菌落接种5mL低盐Luria-Bertani肉汤（LBB），并在37°C下孵育过夜，以200rpm振荡。 为了获得对数期细胞，将200μL过夜培养物接种到5mL LBB中，并在振荡器中以200rpm在37°C下孵育2.5小时。 使用分光光度计测量600nm（OD 600）处的光密度。在 900 μL 无菌 LBB 中使用 100 μL 培养物制备高达 1 x 10−9 的连续稀释液。注意：我们从未稀释的样品开始，以1 x 10 7 CFU / mL结束，我们在1 x 107稀释液中获得了可计数的菌落，因此我们将该稀释度视为最终稀释度。 将100μL每种稀释液涂抹在LBA上，并在37°C下孵育过夜。 根据标准微生物学方案，使用显示可计数菌落（30-300）的稀释液进行菌落计数，并获得菌落形成单位（CFU）。 伤口接种将200μL从过夜培养物接种到5mL的LB肉汤中，并在37°C的振荡器中孵育2.5小时。 在600nm（OD 600）处测量日培养物的光密度。对于 PA01 接种，使用 3 x 10 8 CFU/mL（每个伤口接种 250 μL 1 x 108 CFU/mL PA01）。将接种物装在生物危害容器中运输到动物设施。 在烧伤后第3天使用移液管将接种物分散在暴露伤口的表面上，并使用一次性撒布器均匀分布（图6）。在包扎之前，保持伤口开放约15分钟。注意：所有外科手术、接种、组织活检、成像和包扎均在全身麻醉下进行，如第 3 节和第 4 节所示。 确认感染的确定注意：为了确认伤口在接种后已成功感染，使用了几种方法，并将伤口样本与从正常皮肤收集的样本进行比较;以下是一些示例。对于在不同时间点收集的样本的基于病理学的分析，使用菌落形成单位的计数来估计感染 （CFU; 图 7E、F）。通过穿刺活检收集 6 毫米的伤口组织。标记并称量空的 5 mL 圆底管。将样品转移到试管中，并用样品称量试管。 用手术刀在无菌表面上切碎组织。在 BSL2 引擎盖中执行所有步骤。注意：为确保组织易于均质化，尺寸应非常小（但不小于 0.5 毫米） 将样品放入试管中，加入 1mL PBS。使用硬组织研磨探针混合和研磨组织。 连续稀释（未稀释至1×10-5）匀浆，并在选择性（假单胞菌分离琼脂，PIA）和非选择性（LBA）培养基中接种50μL每种稀释液。 将所有稀释液在37°C的有氧条件下孵育18-24小时。在适当的照明条件下对板进行成像。 选择具有 30-300 个菌落的平板，如果没有一个平板达到该浓度，请使用未稀释的平板。使用ImageJ计算菌落数，并通过将平均值乘以最终稀释因子来计算每板的CFU。 使用扫描电子显微镜（SEM）从接种后第7天和其他时间点收集的样品中获取图像，以确认细菌生物膜的存在（图7G）。注意：选择接种后第 7 天是因为这是生物膜感染建立和烧伤焦痂软化开始的日子，这允许 US 波的穿透，从而可视化更深的组织。 在图 4 中，检查第 3 天的 US 烧伤伤口图像，该图像显示了阻止 US 波通过更深层组织的厚皮革状焦痂。 用针对 铜绿假单胞菌 的特异性抗体对伤检切片进行染色，以确认特定细菌的存在，如先前的出版物13 所示（图7H）。 进行下一代测序 （NGS），发表在 Sinha 等人 31 中。定量从接种后第 7 天开始到研究结束的不同时间点收集的感染伤口和正常未感染皮肤样本中的细菌 16srRNA。 12. 活检采集 收集组织活检进行接种后第 7 天、第 14 天、第 28 天和第 56 天成像后的分析。仅从每个伤口收集一次活检，以尽量减少对愈合过程的干扰。注意：所有外科手术、接种、组织活检、成像和包扎均在全身麻醉下进行，如第 3 节和第 4 节所示。用0.5%布比卡因浸润伤口周围区域。使用带有 10 号刀片的一次性手术刀，从伤口的一个边缘切开一条 3-4 毫米宽的条带，在两侧保持正常皮肤的小边缘。将条带放入装有 4% 缓冲福尔马林的标记锥形管中进行固定。注意：对于早期时间点成像和活检程序，将在手术准备期间给予全剂量的丁丙诺啡。对于晚期活检程序，将在手术准备期间给予半剂量的丁丙诺啡。在所有烧伤和活检程序后，加巴喷丁将按照主治兽医的建议给予长达 7 天的 BID。卡洛芬将在术后几天或按照主治兽医的建议服用。 从伤口（从伤口床或伤口边缘）切出 6 毫米的穿孔活检。从伤口边缘收集，包括部分正常皮肤和伤口床，用于不同类型的分析。 使用灭菌的镊子和解剖剪刀取出样品。将活检样本放入适当的试管或盒中进行处理和分析。 对于 CFU、SEM、RNA 和 FPPE，使用适当的缓冲液将样品保存在试管中。例如，可以将样品放入盒式 OCT 中，用于激光捕获显微镜 （LCM） 和免疫组织化学 （IHC）。 收集样本后，用无菌纱布轻轻按压伤口，实现止血。用不粘连的敷料和绷带覆盖伤口，如第 9 节所示。 13. 安乐死和组织采集 在安乐死当天用TKX镇静猪，并用异氟醚麻醉。按照第 3 节中概述的步骤将静脉导管放置在边缘耳静脉中。按照第 4 节中的步骤对猪进行插管。 猪被麻醉后取下绷带，并清洁伤口周围的区域。 完整的数码摄影、LSI、TEWL 和 HUSD 成像。按照第 12 节中概述的步骤从伤口和正常皮肤中收集样本。 一旦收集了所有必需的样本， 通过 静脉注射市售的安乐死溶液（戊巴比妥钠）对仍处于麻醉状态的猪进行人道安乐死。使用听诊器听诊以确认心跳停止和自主呼吸。 按照 SOM IACUC 的要求，使用手术刀诱发气胸，执行安乐死的辅助方法。将猪胴体转移到桶中，然后运输到冷冻室进行焚烧。