Un modelo de ratón para la neovascularización corneal por quemadura alcalina

Todo el trabajo con animales, incluidos los procedimientos experimentales y la eutanasia, fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Baylor College of Medicine con el número de protocolo AN-8790. 1. Preparación de NaOH 1 N Agregue 4 ml de agua desionizada estéril a un tubo de centrífuga de 15 ml. Pesa 400 mg de hidróxido de sodio (NaOH) y agrégalos al tubo con cuidado. Disuelva el NaOH agitando lentamente la solución con una varilla de vidrio. Aumente el volumen a 10 ml agregando agua desionizada estéril al tubo y mezcle nuevamente invirtiendo suavemente el tubo hacia arriba y hacia abajo. Cierre bien la tapa y guarde la solución a temperatura ambiente. Prepare la solución fresca todos los meses porque la concentración de la solución de NaOH puede reducirse si la solución absorbe dióxido de carbono en el aire. Mezcle siempre suavemente la solución de NaOH antes de usarla.PRECAUCIÓN: Prepare la solución dentro de una cubierta química y use el equipo de protección personal (EPP) adecuado. 2. Preparación de la solución de paraformaldehído (PFA) al 4% Agregue 30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x a un vaso de precipitados de vidrio. Pesa 4 g de paraformaldehído (PFA) y añádelo al vaso de precipitados. Mantener el vaso de precipitados en una placa calefactora a 60 °C agitando. Agregue la solución de NaOH 1 N gota a gota para elevar el pH hasta que la solución se aclare. Verifique y ajuste el pH a 7.4 usando ácido clorhídrico (HCl) 1 N. Ajuste el volumen final a 50 ml con 1x PBS. Enfríe y filtre la solución. Almacenar la solución a 4 °C.PRECAUCIÓN: Prepare la solución en una campana extractora mientras usa el EPP adecuado. 3. Preparación del cóctel de ketamina y xilacina Prepare el cóctel de ketamina/xilacina añadiendo 0,8 ml de ketamina (concentración de stock: 100 mg/mL) y 0,16 mL de xilacina (concentración de stock: 100 mg/mL) a 9,4 mL de solución salina. Guarde el cóctel en frascos de inyección estériles a temperatura ambiente (RT). 4. Quemadura alcalina en la córnea del ratón Inyecte meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea 30 minutos antes del procedimiento para aliviar el dolor. Anestesiar a los ratones (C57BL/6J, 6-8 semanas de edad, machos) mediante una inyección i.p. del cóctel ketamina/xilacina (ketamina 80 mg/kg y xilacina 16 mg/kg de peso corporal). Compruebe la respuesta refleja (retirada del pedal) pellizcando los dedos del ratón y confirme la ausencia del reflejo. Aplique una gota de anestésico tópico, proparacaína al 0,5%, en la superficie corneal de un ojo y una gota de lágrimas artificiales en el otro ojo. Con un punzón de biopsia de 2 mm, perfore los discos de papel de filtro Whatman. Agregue 2 μL de NaOH 1N a una placa de Petri limpia. Coloque el disco de papel de filtro de 2 mm sobre la gota de NaOH 1 N y déjelo en remojo durante 15 s. Tome el papel de filtro con pinzas y aplique el papel de filtro en el ojo tratado con proparacaína en el centro de la córnea durante 30 segundos.NOTA: El papel de filtro debe tocar solo el centro de la córnea, y se debe tener cuidado de evitar el movimiento del papel de filtro una vez colocado, ya que mover el papel de filtro puede causar quemaduras en los tejidos adyacentes. Lávese el ojo enjuagándolo con 20 ml de solución salina estéril en una jeringa estéril.NOTA: Se debe tener cuidado para asegurarse de que la córnea, junto con el saco conjuntival, se lave a fondo para garantizar que no se dañe más la córnea o el tejido circundante. Lavar el saco conjuntival prevendrá aún más el sínbler. Limpie suavemente el exceso de solución salina de los ojos y el área circundante con toallitas suaves desechables. Después, mantenga a los ratones en una jaula de recuperación sobre una almohadilla térmica tibia hasta que deambulen.NOTA: Los ratones se monitorean diariamente después de la quemadura alcalina durante 3 días. Si se observan síntomas de dolor o estrés, se administra meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea. 5. Examen y evaluación de la neovascularización y opacidad En ratones anestesiados, examinar los ojos bajo un microscopio de disección el día 10 después de la quemadura, y obtener imágenes utilizando una cámara conectada al telescopio de disección para puntuar la opacidad y la neovascularización.NOTA: Un endoscopio de disección normal con una cámara acoplada es suficiente. Mientras observa la córnea a través del microscopio de disección, puntúe la opacidad después de la quemadura en función de la siguiente escala12:0 = Sin opacidad; córnea transparente1 = Opacidad leve; ligera opacidad en las áreas del iris y la pupila; iris y pupila fácilmente visibles2 = Opacidad moderada; iris y pupila apenas visibles3 = Opacidad severa; iris o pupila no visibles4 = Córnea opaca; iris y pupila no visibles Mientras observa la córnea a través del microscopio de disección, puntúe la CoNV en función de la siguiente escala12:0 = Sin neovascularización; No hay nuevos vasos del limbo1 = Neovascularización leve; Nuevos vasos que se originan en el limbo2 = Neovascularización moderada; Los vasos sanguíneos se originaron en el limbo y crecieron hacia el centro de la córnea3 = Neovascularización grave; vasos sanguíneos que se originan en el limbo y alcanzan y/o cruzan el centro de la córnea Utilice una prueba t de Student para comparar estadísticamente las puntuaciones de opacidad y neovascularización entre los grupos de quemaduras alcalinas y ojos sanos. Eutanasiar a los ratones el día 10 mediante la exposición al isoflurano al 5% hasta 1 minuto después de que se detenga la respiración, seguida de una dislocación cervical, y recolectar las córneas para obtener imágenes de montaje plano. 6. Imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) Tome imágenes OCT del segmento anterior de los ojos en ratones anestesiados el día 10 después de la quemadura. Realice la adquisición de imágenes OCT como un escaneo de volumen utilizando el modo IR + OCT con un campo de visión de 30° y una intensidad IR del 100 %. Cuantifique el grosor de las córneas con el software ImageJ. Para medir el grosor, utilice la herramienta Selección de líneas del software ImageJ para crear una línea recta entre las superficies anterior y posterior en la córnea central. Haga clic en Analizar > medir en las herramientas de software para transferir los valores a la ventana de datos. Copie los valores en un archivo de hoja de cálculo y compare estadísticamente el grosor de la córnea entre la quemadura alcalina y los grupos de ojos sanos utilizando una prueba t de Student.NOTA: El grosor de la córnea es la distancia desde un punto en la superficie corneal anterior hasta el punto más cercano en la superficie corneal posterior en el centro de la córnea. 7. Inmunotinción para CoNV en córneas de montaje plano Sacrificar a los ratones el día 10 después de la quemadura alcalina y enuclear los ojos mediante disección roma. Separe los párpados con los dedos pulgar e índice, y coloque pinzas debajo del globo ocular. Cierre las pinzas y retire suavemente el globo ocular de la órbita. Coloque los globos oculares en 1x PBS. Para cada globo ocular, retire la córnea del globo ocular haciendo primero una incisión con una aguja de 30 G por debajo del área del limbo. Corta alrededor de la zona del limbo con unas microtijeras corneales, con la incisión como punto de partida, y separa lentamente la córnea y el limbo del globo. Limpie las córneas suavemente con un pincel fino para eliminar el iris. Fijar las córneas en paraformaldehído al 4% durante 1 h. Lave las córneas tres veces durante 20 minutos cada una en 1x PBS a temperatura ambiente (RT). Incubar en un tampón de bloqueo (1x PBS suplementado con 0,1% de Triton-X 100 y 5% de albúmina sérica bovina [BSA]) durante 1 h a RT. Transfiera las córneas a una solución de anticuerpos que contenga anticuerpos primarios. Prepare la solución de anticuerpos en 1x PBS suplementado con BSA al 1 %, Triton-X 100 al 0,1 %, AcM anti-CD31 conjugado con Dylight550 (1:100) y AcM anti-LYVE-1 conjugado con Alexa Fluor488 (1:100). Incubar durante 3 días a 4 °C. Lave las córneas en 1x PBS tres veces durante 20 minutos cada una. Tiñir los núcleos con solución de tinción de Hoechst (1:1.000) durante 5 min en la oscuridad. Aplana las córneas con cortes radiales y móntalas en un portaobjetos de vidrio previamente limpiado con medio de montaje y cubreobjetos. Selle los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y seque los portaobjetos durante la noche en la oscuridad antes de analizarlos con microscopía confocal. Obtener imágenes de las córneas de montaje plano mediante microscopía confocal mediante la unión de imágenes individuales de la pila Z; Utilice un objetivo de 10x, láseres de 488 nm y 561 nm, y una resolución de 512 píxeles x 512 píxeles por corte en escáneres Galvano no resonantes. Cuantifique la densidad de la sangre CD31+ y de los vasos linfáticos LYVE-1+ utilizando el software ImageJ. Para determinar la densidad vascular, convierta las imágenes confocales en una imagen de 8 bits. Elija Densidad vascular en los complementos. Elija la región de interés en la imagen y haga clic en Aceptar. Las mediciones se abrirán en una nueva ventana de datos. Copie los valores en un archivo de hoja de cálculo y compare estadísticamente la densidad vascular entre los grupos de quemaduras alcalinas y ojos sanos mediante una prueba t de Student.NOTA: CD31, también llamada molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM-1), es una molécula de adhesión celular involucrada en la angiogénesis y está altamente expresada en las células endoteliales de los vasos sanguíneos tempranos y maduros13. LYVE-1 (receptor de hialuronano endotelial de vasos linfáticos-1) es un marcador de superficie celular en las células endoteliales linfáticas y puede utilizarse como marcador de linfangiogénesis14.