Modelo de neovascularização da córnea em camundongos por queimadura alcalina

Todo o trabalho com animais, incluindo os procedimentos experimentais e a eutanásia, foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Baylor College of Medicine com o número de protocolo AN-8790. 1. Preparação de 1 N NaOH Adicionar 4 mL de água deionizada estéril a um tubo centrífugo de 15 mL. Pesar 400 mg de hidróxido de sódio (NaOH) e adicionar ao tubo cuidadosamente. Dissolva o NaOH agitando lentamente a solução usando uma haste de vidro. Completar o volume para 10 mL adicionando água deionizada estéril ao tubo e misturar novamente invertendo suavemente o tubo para cima e para baixo. Feche bem a tampa e guarde a solução à temperatura ambiente. Prepare a solução fresca todos os meses porque a concentração da solução de NaOH pode ser reduzida pela solução que absorve dióxido de carbono no ar. Misture sempre suavemente a solução de NaOH antes de usar.CUIDADO: Prepare a solução dentro de um exaustor químico e use equipamentos de proteção individual (EPIs) apropriados. 2. Preparação da solução de paraformaldeído (PFA) a 4% Adicionar 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a um copo de vidro. Pese 4 g de paraformaldeído (PFA) e junte-o ao copo. Mantenha o copo numa placa quente a 60 °C com agitação. Adicione a solução de NaOH 1 N gota a gota para elevar o pH até que a solução limpe. Verificar e ajustar o pH para 7,4 utilizando 1 N de ácido clorídrico (HCl). Ajustar o volume final para 50 mL com 1x PBS. Arrefecer e filtrar a solução. Conservar a solução a 4 °C.CUIDADO: Prepare a solução em um exaustor enquanto estiver usando EPI apropriado. 3. Preparação do coquetel de ketamina/xilazina Preparar o coquetel de cetamina/xilazina adicionando 0,8 mL de cetamina (concentração estoque: 100 mg/mL) e 0,16 mL de xilazina (concentração estoque: 100 mg/mL) a 9,4 mL de solução salina. Armazenar o cocktail em frascos de injeção estéreis à temperatura ambiente (TR). 4. Queimadura alcalina na córnea do rato Injetar meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) por via subcutânea 30 minutos antes do procedimento para alívio da dor. Anestesiar os camundongos (C57BL/6J, 6-8 semanas de idade, machos) usando uma injeção i.p. do coquetel cetamina/xilazina (Ketamina 80 mg/kg e Xilazina 16 mg/kg de peso corporal). Verifique a resposta reflexa (retirada do pedal) apertando os dedos dos pés do mouse e confirme a ausência do reflexo. Aplicar uma gota de anestésico tópico, proparacaína a 0,5%, na superfície corneana de um olho e uma gota de lágrimas artificiais no outro olho. Usando um punch de biópsia de 2 mm, perfure os discos de papel de filtro Whatman. Adicionar 2 μL de NaOH 1N a uma placa de Petri limpa. Coloque o disco de papel filtro de 2 mm sobre a gota de NaOH de 1 N e deixe de molho por 15 s. Pegue o papel filtro com pinça e aplique o papel filtro no olho tratado com proparacaína no centro da córnea por 30 s.OBS: O papel filtro deve estar tocando apenas o centro da córnea, e deve-se tomar cuidado para evitar a movimentação do papel filtro uma vez colocado, pois mover o papel filtro pode causar queimaduras nos tecidos adjacentes. Lave o olho lavando com 20 mL de solução salina estéril em uma seringa estéril.NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que a córnea, juntamente com o saco conjuntival, seja lavada cuidadosamente para garantir que não haja mais danos à córnea ou ao tecido circundante. Lavar o saco conjuntival evitará ainda mais o simbléfaro. Limpe suavemente o excesso de soro fisiológico dos olhos e da área circundante usando lenços descartáveis macios. Depois, mantenha os ratos em uma gaiola de recuperação em uma almofada de aquecimento aquecida até o deambulação.NOTA: Os ratos são monitorados diariamente após a queimadura alcalina por 3 dias. Se forem observados sintomas de dor ou stress, meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) é administrado por via subcutânea. 5. Exame e avaliação da neovascularização e opacidade Em camundongos anestesiados, examinar os olhos sob um microscópio de dissecção no dia 10 após a queimadura e obter imagens usando uma câmera acoplada ao escopo de dissecção para pontuar a opacidade e a neovascularização.NOTA: Um escopo de dissecção regular com uma câmera conectada é suficiente. Ao observar a córnea através do microscópio de dissecção, pontuar a opacidade após a queimadura com base na seguinteescala12:0 = Sem opacidade; córnea clara1 = Opacidade leve; ligeira nebulosidade nas áreas da íris e pupilas; íris e pupila facilmente visíveis2 = Opacidade moderada; íris e pupila pouco visíveis3 = Opacidade grave; íris ou pupila não visíveis4 = Córnea opaca; íris e pupila não visíveis Ao observar a córnea através do microscópio de dissecção, pontuar a CoNV com base na seguinteescala12:0 = Sem neovascularização; ausência de novos vasos do limbo1 = Neovascularização leve; novos navios originários do limbo2 = Neovascularização moderada; vasos sanguíneos originados do limbo e crescendo em direção ao centro da córnea3 = Neovascularização grave; vasos sanguíneos que se originam do limbo e atingem e/ou atravessam o centro da córnea Use o teste t de Student para comparar estatisticamente os escores de opacidade e neovascularização entre os grupos de queimadura alcalina e olhos saudáveis. Eutanasiar os camundongos no dia 10 por exposição ao isoflurano a 5% até 1 min após a parada respiratória, seguida de luxação cervical, e coletar as córneas para imagens de montagem plana. 6. Tomografia de coerência óptica (OCT) Tire imagens de OCT do segmento anterior dos olhos em camundongos anestesiados no dia 10 após a queimadura. Realize a aquisição de imagens da OCT como uma varredura de volume usando o modo IR + OCT com um campo de visão de 30° e 100% de intensidade IR. Quantifique a espessura das córneas utilizando o software ImageJ. Para medir a espessura, use a ferramenta Seleção de linha no software ImageJ para criar uma linha reta entre as superfícies anterior e posterior na córnea central. Clique em Analisar > Medir nas ferramentas de software para transferir os valores para a janela de dados. Copie os valores para um arquivo de planilha e compare estatisticamente a espessura da córnea entre os grupos de queimadura alcalina e olhos saudáveis usando um teste t de Student.NOTA: A espessura da córnea é a distância de um ponto na superfície anterior da córnea até o ponto mais próximo na superfície posterior da córnea no centro da córnea. 7. Imunomarcação para CoNV em córneas planas Eutanasiar os camundongos no dia 10 pós-queimadura alcalina e enuclear os olhos por dissecção romba. Afaste as pálpebras usando os dedos polegar e indicador e coloque pinças sob o globo ocular. Feche a pinça e puxe suavemente o globo ocular para fora da órbita. Coloque os globos oculares em 1x PBS. Para cada globo ocular, remova a córnea do globo ocular fazendo primeiro uma incisão usando uma agulha de 30 G abaixo da área do limbo. Cortar ao redor da área do limbo usando microtesoura corneana, com a incisão como ponto de partida, e separar lentamente a córnea e o limbo do globo terrestre. Limpe as córneas suavemente usando um pincel fino para remover a íris. Fixar as córneas em paraformaldeído a 4% por 1 h. Lave as córneas três vezes por 20 min cada em 1x PBS à temperatura ambiente (TR). Incubar em tampão de bloqueio (1x PBS suplementado com 0,1% de Triton-X 100 e 5% de albumina de soro bovino [BSA]) por 1 h no TR. Transfira as córneas para uma solução de anticorpos contendo anticorpos primários. Preparar a solução de anticorpos em 1x PBS suplementado com BSA a 1%, Triton-X 100 a 0,1%, Dylight550-conjugado anti-CD31 mAb (1:100) e Alexa Fluor488-conjugado anti-LYVE-1 mAb (1:100). Incubar durante 3 dias a 4 °C. Lave as córneas em 1x PBS três vezes por 20 min cada. Manchar os núcleos usando solução de coloração Hoechst (1:1.000) por 5 min no escuro. Achate as córneas com cortes radiais e monte-as em uma lâmina de vidro pré-limpa usando meio de montagem e lamínulas. Selar as lamínulas com esmalte transparente e secar as lâminas durante a noite no escuro antes da análise por microscopia confocal. Imagem das córneas planas usando microscopia confocal costurando imagens individuais Z-stack; Use uma objetiva de 10x, lasers de 488 nm e 561 nm e uma resolução de 512 pixels x 512 pixels por fatia em scanners Galvano não ressonantes. Quantifique a densidade dos vasos sanguíneos CD31+ e linfáticos LYVE-1+ usando o software ImageJ. Para determinar a densidade vascular, converta as imagens confocais em uma imagem de 8 bits. Escolha Densidade Vascular nos Plugins. Escolha a região de interesse na imagem e clique em OK. As medições serão abertas em uma nova janela de dados. Copie os valores para um arquivo de planilha e compare estatisticamente a densidade vascular entre os grupos de queimadura alcalina e olhos saudáveis usando um teste t de Student.NOTA: CD31, também chamada de molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias-1 (PECAM-1), é uma molécula de adesão celular envolvida na angiogênese e é altamente expressa nas células endoteliais de vasos sanguíneos precoces e maduros13. O LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1) é um marcador de superfície celular em células endoteliais linfáticas e pode ser usado como marcador de linfangiogênese14.