알칼리 화상에 의한 각막 신생혈관 형성을 위한 마우스 모델

실험 절차와 안락사를 포함한 모든 동물 실험은 베일러 의과대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 프로토콜 번호는 AN-8790입니다. 1. 1N NaOH의 제조 15mL 원심분리기 튜브에 4mL의 멸균 탈이온수를 추가합니다. 수산화나트륨(NaOH) 400mg의 무게를 측정하고 튜브에 조심스럽게 추가합니다. 유리 막대를 사용하여 용액을 천천히 저어 NaOH를 녹입니다. 튜브에 멸균 탈이온수를 추가하여 부피를 10mL로 만들고 튜브를 위아래로 부드럽게 뒤집어 다시 혼합합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 용액을 실온에 보관하십시오. 공기 중의 이산화탄소를 흡수하는 용액에 의해 NaOH 용액의 농도가 감소할 수 있으므로 매월 신선한 용액을 준비하십시오. 사용하기 전에 항상 NaOH 용액을 부드럽게 혼합하십시오.주의 : 화학 후드 안에 용액을 준비하고 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 2. 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액의 제조 유리 비커에 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 30mL를 추가합니다. 파라포름알데히드(PFA) 4g의 무게를 측정하여 비커에 넣습니다. 비커를 60°C의 열판에 놓고 저어줍니다. 1N NaOH 용액을 적가하여 용액이 맑아질 때까지 pH를 높입니다. 7.4N 염산(HCl)을 사용하여 pH를 확인하고 1로 조정합니다. 1x PBS를 사용하여 최종 용량을 50mL로 조정합니다. 용액을 식히고 여과하십시오. 용액을 4°C에서 보관합니다.주의 : 적절한 PPE를 착용한 상태에서 흄 후드에 용액을 준비하십시오. 3. 케타민/자일라진 칵테일 준비 식염수 9.4mL에 케타민 0.8mL(원액 농도: 100mg/mL)와 자일라진 0.16mL(원액 농도: 100mg/mL)를 첨가하여 케타민/자일라진 칵테일을 준비합니다. 칵테일을 멸균 주입 병에 담아 실온(RT)에 보관합니다. 4. 쥐 각막에 알칼리 화상 통증 완화를 위해 시술 30분 전에 멜록시캠(체중 4-6mg/kg)을 피하 주사합니다. 케타민/자일라진 칵테일(케타민 80mg/kg 및 자일라진 16mg/kg)의 i.p. 주사를 사용하여 마우스(C57BL/6J, 생후 6-8주, 수컷)를 마취합니다. 마우스의 발가락을 꼬집어 반사 반응(페달 철수)을 확인하고 반사가 없는지 확인합니다. 한쪽 눈의 각막 표면에 국소 마취제인 0.5% 프로파라카인을 한 방울 떨어뜨리고 다른 쪽 눈에는 인공 눈물 한 방울을 바릅니다. 2mm 생검 펀치를 사용하여 Whatman 여과지 디스크를 펀칭합니다. 깨끗한 페트리 접시에 2μL의 1N NaOH를 추가합니다. 2mm 여과지 디스크를 1N NaOH 방울에 놓고 15초 동안 담가둡니다. 집게로 여과지를 집어 들고 각막 중앙의 프로파라카인 처리된 눈에 30초 동안 여과지를 바릅니다.알림: 여과지는 각막의 중앙에만 닿아야 하며, 여과지를 움직이면 인접 조직에 화상을 입을 수 있으므로 일단 놓은 여과지가 움직이지 않도록 주의해야 합니다. 멸균 주사기에 멸균 식염수 20mL로 씻어내어 눈을 씻습니다.알림: 각막이나 주변 조직이 더 이상 손상되지 않도록 결막낭과 함께 각막을 철저히 씻어야 합니다. 결막낭을 씻으면 결막낭을 더 예방할 수 있습니다. 일회용 물티슈를 사용하여 눈과 주변 부위의 과도한 식염수를 부드럽게 닦아냅니다. 그런 다음 보행이 가능할 때까지 따뜻한 가열 패드의 회복 케이지에 쥐를 보관하십시오.알림: 마우스는 알칼리 연소 후 3일 동안 매일 모니터링됩니다. 통증이나 스트레스 증상이 관찰되면 멜록시캠(체중 4-6mg/kg)을 피하 투여합니다. 5. 신생혈관 형성 및 불투명도의 검사 및 평가 마취된 마우스의 경우 화상 후 10일째에 해부 현미경으로 눈을 검사하고 해부 스코프에 부착된 카메라를 사용하여 이미지를 획득하여 불투명도 및 신생혈관 형성을 채점합니다.알림: 카메라가 부착된 일반 해부 스코프로 충분합니다. 박리 현미경을 통해 각막을 관찰하면서 다음 척도12를 기준으로 화상 후 불투명도를 채점합니다.0 = 불투명도 없음; 투명 각막1 = 약한 불투명도; 홍채와 동공 부위에 약간의 흐릿함이 있음; 홍채와 동공을 쉽게 볼 수 있습니다.2 = 보통 불투명도; 홍채와 눈동자가 거의 보이지 않음3 = 심한 불투명도; 홍채 또는 동공이 보이지 않음4 = 불투명 각막; 홍채와 동공이 보이지 않음 해부 현미경을 통해 각막을 관찰하면서 다음 척도12를 기준으로 CoNV를 채점합니다.0 = 신생혈관 형성 없음; 림버스에서 새로운 선박이 없습니다.1 = 경미한 신생혈관 형성; 림버스(Limbus)에서 출발하는 새로운 선박2 = 중등도의 신생혈관 형성; 혈관은 림버스(limbus)에서 시작되어 각막의 중앙을 향해 자랍니다3 = 심한 신생혈관 형성; 림버스(limbus)에서 시작되어 각막의 중심에 도달하거나 교차하는 혈관 스튜던트 t-검정을 사용하여 알칼리 화상과 건강한 안구 간의 불투명도 및 신생혈관 형성 점수를 통계적으로 비교합니다. 호흡이 멈춘 후 1분까지 1%의 이소플루란에 노출된 후 자궁경부 탈구가 뒤따를 때까지 10일째에 쥐를 안락사시키고 평탄한 마운트 이미징을 위해 각막을 채취합니다. 6. 광간섭 단층촬영(OCT) 영상 화상 후 10일째에 마취된 쥐에서 눈의 앞쪽 부분의 OCT 이미지를 촬영합니다. 30° 시야각과 100% IR 강도의 IR + OCT 모드를 사용하여 볼륨 스캔으로 OCT 이미지 획득을 수행합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각막의 두께를 정량화합니다. 두께를 측정하려면 ImageJ 소프트웨어의 선 선택 도구를 사용하여 중앙 각막의 전방 표면과 후방 표면 사이에 직선을 만듭니다. 소프트웨어 도구에서 Analyze > Measure 를 클릭하여 값을 데이터 창으로 전송합니다. 값을 스프레드시트 파일에 복사하고 스튜던트 t-검정을 사용하여 알칼리 화상과 건강한 안구 그룹 간의 각막 두께를 통계적으로 비교합니다.참고: 각막의 두께는 전방 각막 표면의 한 지점에서 각막 중심의 후방 각막 표면에서 가장 가까운 지점까지의 거리입니다. 7. 편평한 거치형 각막의 CoNV에 대한 면역염색 알칼리 화상 후 10일째에 쥐를 안락사시키고 둔기 해부로 눈을 적출시킵니다. 엄지와 검지를 사용하여 눈꺼풀을 벌리고 눈 구슬 아래에 집게를 놓습니다. 집게를 닫고 안구를 안와에서 부드럽게 잡아당깁니다. 안구를 1x PBS에 배치합니다. 각 안구에 대해 먼저 연정 부위 아래 30G 바늘을 사용하여 절개하여 안구에서 각막을 제거합니다. 절개를 시작점으로 각막 마이크로 가위를 사용하여 변막 부위를 자르고 각막과 변두리를 구체에서 천천히 분리합니다. 가는 붓을 사용하여 각막을 부드럽게 청소하여 홍채를 제거합니다. 각막을 4% 파라포름알데히드에 1시간 동안 고정합니다. 실온(RT)에서 1x PBS에서 각각 20분 동안 각막을 세 번 세척합니다. 차단 완충액(0.1% Triton-X 100 및 5% 소 혈청 알부민[BSA]이 보충된 PBS 1개)에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 각막을 1차 항체가 포함된 항체 용액으로 옮깁니다. 1% BSA, 0.1% Triton-X 100, Dylight550-conjugated anti-CD31 mAb(1:100) 및 Alexa Fluor488-conjugated anti-LYVE-1 mAb(1:100)가 보충된 1x PBS에서 항체 용액을 준비합니다. 4 °C에서 3일 동안 배양합니다. 각막을 1x PBS에서 각각 20분 동안 세 번 세척합니다. 어둠 속에서 Hoechst 염색 용액(1:1,000)을 사용하여 5분 동안 핵을 염색합니다. 방사형 절단으로 각막을 평평하게 하고 장착 매체와 커버슬립을 사용하여 미리 청소된 유리 슬라이드에 장착합니다. 투명한 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하고 컨포칼 현미경으로 분석하기 전에 어두운 곳에서 슬라이드를 밤새 건조시킵니다. 개별 Z 스택 이미지를 스티칭하여 컨포칼 현미경을 사용하여 편평하게 장착된 각막을 이미지화합니다. 10x 대물렌즈, 488nm 및 561nm 레이저, 슬라이스당 512픽셀 x 512픽셀의 해상도를 비공진 Galvano 스캐너에서 사용할 수 있습니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 CD31+ 혈액 및 LYVE-1+ 림프관의 밀도를 정량화합니다. 혈관 밀도를 확인하려면 컨포칼 영상을 8비트 영상으로 변환하십시오. 플러그인(Plugins) 에서 혈관 밀도(Vascular Density) 를 선택합니다. 이미지에서 관심 영역을 선택하고 확인을 클릭합니다. 측정값이 새 데이터 창에서 열립니다. 값을 스프레드시트 파일에 복사하고 스튜던트 t-검정을 사용하여 알칼리 화상군과 건강한 안구 그룹 간의 혈관 밀도를 통계적으로 비교합니다.참고: 혈소판 내피 세포 접착 분자-1(PECAM-1)이라고도 하는 CD31은 혈관 신생에 관여하는 세포 접착 분자이며 초기 및 성숙 혈관의 내피 세포에서 많이 발현됩니다13. LYVE-1(림프관 내피 히알루로난 수용체-1)은 림프관 내피 세포의 세포 표면 마커이며 림프관 형성 마커로 사용할 수 있다14.