アルカリ熱傷による角膜血管新生術のマウスモデル

実験手順と安楽死を含むすべての動物研究は、ベイラー医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によってプロトコル番号AN-8790で承認されました。 1. 1 N NaOHの調製 15 mLの遠心チューブに4 mLの滅菌脱イオン水を加えます。400 mgの水酸化ナトリウム(NaOH)を秤量し、チューブに慎重に加えます。 ガラス棒を用いて溶液をゆっくりと攪拌することにより、NaOHを溶解する。チューブに滅菌脱イオン水を加えて容量を10 mLに増やし、チューブを上下に静かに反転させて再度混合します。キャップをしっかりと閉め、溶液を室温で保存します。 NaOH溶液は、溶液が空気中の二酸化炭素を吸収することで濃度が低下する可能性があるため、毎月新鮮な溶液を調製してください。 使用前に必ずNaOH溶液を静かに混合してください。注意: 薬品フード内で溶液を調製し、適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。 2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液の調製 30 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をガラスビーカーに加えます。パラホルムアルデヒド(PFA)4gを秤量し、ビーカーに加えます。 ビーカーを60°Cのホットプレートに置き、攪拌します。1 N NaOH溶液を滴下し、溶液が透明になるまでpHを上げます。 1 N 塩酸 (HCl) を使用して pH を確認し、7.4 に調整します。最終容量を 1x PBS で 50 mL に調整します。 溶液を冷却してろ過します。溶液を4°Cで保存します。注意: 適切なPPEを着用しながら、ドラフト内で溶液を調製します。 3.ケタミン/キシラジンカクテルの準備 生理食塩水9.4 mLにケタミン0.8 mL(ストック濃度:100 mg/mL)とキシラジン0.16 mL(ストック濃度:100 mg/mL)を加えて、ケタミン/キシラジンカクテルを調製します。 カクテルを滅菌注射ボトルに入れて室温(RT)で保管します。 4.マウス角膜のアルカリ焼け 痛みを和らげるために、手順の30分前にメロキシカム(体重4〜6 mg / kg)を皮下に注射します。.ケタミン/キシラジンカクテル(ケタミン80mg/kgおよびキシラジン16mg/kg体重)のi.p.注射を用いて、マウス(C57BL / 6J、6-8週齢、雄)に麻酔をかけます。 マウスのつま先をつまんで反射反応(ペダルの引き込み)を確認し、反射がないことを確認します。局所麻酔薬、0.5%プロパラカインを片方の目の角膜表面に1滴、もう片方の目に人工涙液を1滴塗布します。. 2mmの生検パンチを使用して、Whatman濾紙ディスクを打ち抜きます。 2 μLの1N NaOHを清潔なペトリ皿に加えます。2 mm の濾紙ディスクを 1 N NaOH ドロップの上に置き、15 秒間浸します。 鉗子でろ紙を拾い上げ、角膜の中心にあるプロパラカイン処理された目にろ紙を30秒間塗布します。注意: ろ紙は角膜の中心にのみ触れている必要があり、ろ紙を動かすと隣接する組織に火傷を負う可能性があるため、一度置いたろ紙が動かないように注意する必要があります。 滅菌シリンジで20 mLの滅菌生理食塩水で洗い流して目を洗います。注意: 角膜や周囲の組織にそれ以上の損傷を与えないように、角膜と結膜嚢を完全に洗浄するように注意する必要があります。結膜嚢を洗浄すると、シンブルファロンがさらに予防されます。 使い捨てのソフトワイプを使用して、目や周囲から余分な生理食塩水をやさしく拭き取ります。その後、歩行可能になるまで、マウスを温かい加熱パッドの上の回復ケージに入れておきます。注:マウスは、アルカリ燃焼後3日間毎日監視されます。痛みやストレスの症状が見られる場合は、メロキシカム(体重4〜6 mg / kg)を皮下投与します。. 5.血管新生と混濁の検査と評価 麻酔をかけたマウスでは、火傷後10日目に解剖顕微鏡で眼を検査し、解剖スコープに取り付けたカメラで画像を取得し、混濁と血管新生をスコアリングします。注:カメラを取り付けた通常の解剖スコープで十分です。 解剖顕微鏡で角膜を観察しながら、次のスケール12に基づいて火傷後の不透明度をスコアリングします。0 = 不透明度なし。透明な角膜1 = 軽度の不透明度。虹彩と瞳孔の領域にわずかなぼやけがある。虹彩と瞳孔が見やすい2 = 中程度の不透明度。虹彩と瞳孔がかろうじて見える3 = 不透明度が厳しい。虹彩または瞳孔が見えない4 =不透明な角膜;虹彩と瞳孔が見えない 解剖顕微鏡で角膜を観察しながら、次のスケール12に基づいてCoNVをスコアリングします。0 =血管新生なし。辺縁部から新しい血管はありません1 =軽度の血管新生;辺縁部に由来する新しい血管2 =中等度の血管新生;血管は辺縁部から始まり、角膜の中心に向かって成長しています3 =重度の血管新生;辺縁部から発生し、角膜の中心に到達および/または交差する血管 スチューデントのt検定を使用して、アルカリ熱傷群と健康な眼群の混濁度と血管新生スコアを統計的に比較します。 10日目に呼吸停止後1分まで5%のイソフルラン曝露によりマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、フラットマウントイメージングのために角膜を採取します。 6. 光干渉断層撮影(OCT)イメージング 火傷後10日目に麻酔をかけたマウスの眼の前部のOCT画像を撮影します。視野角30°、IR強度100%のIR +OCT モードを使用して、ボリュームスキャンとしてOCT画像取得を実行します。 ImageJソフトウェアを使用して角膜の厚さを定量化します。 厚さを測定するには、ImageJ ソフトウェアの 線選択 ツールを使用して、角膜中央の前面と後面の間に直線を作成します。 ソフトウェアツールの [分析>測定 ]をクリックして、値をデータウィンドウに転送します。 値をスプレッドシートファイルにコピーし、スチューデントのt検定を使用して、アルカリ焼けした眼球群と健康な眼球群の角膜の厚さを統計的に比較します。注:角膜の厚さは、角膜前部表面上の点から角膜中心の後角膜表面上の最も近い点までの距離です。 7. フラットマウント角膜におけるCoNVの免疫染色 アルカリ燃焼後10日目にマウスを安楽死させ、鈍的解剖によって眼球を摘出する。 親指と人差し指を使ってまぶたを引き離し、鉗子をアイグローブの下に置きます。鉗子を閉じ、眼球を眼窩からそっと引き抜きます。 眼球を1x PBSに入れます。眼球ごとに、最初に辺縁部の下に30Gの針を使用して切開を行い、アイグローブから角膜を取り除きます。 角膜マイクロハサミを使用して、切開を出発点として辺縁部の周りを切断し、角膜と辺縁部を地球からゆっくりと分離します。 細い絵筆を使って角膜をやさしく掃除し、虹彩を取り除きます。角膜を4%パラホルムアルデヒドで1時間固定します。 角膜を室温(室温)で1x PBSで20分間ずつ3回洗浄します。 ブロッキングバッファー(0.1% Triton-X 100および5%ウシ血清アルブミン[BSA]を添加したPBS1個)中で室温で1時間インキュベートします。 角膜を一次抗体を含む抗体溶液に移します。1% BSA、0.1% Triton-X 100、Dylight550標識抗CD31 mAb(1:100)、Alexa Fluor488標識抗LYVE-1 mAb(1:100)を添加した1x PBSで抗体溶液を調製します。 4°Cで3日間インキュベートします。 角膜を1x PBSで3回、それぞれ20分間洗浄します。 ヘキスト染色液(1:1,000)を用いて、暗所で5分間核を染色します。 角膜を放射状の切り込みで平らにし、封入剤とカバーガラスを使用して事前に洗浄したスライドガラスに取り付けます。カバーガラスを透明なマニキュアで密封し、スライドを暗所で一晩乾燥させてから、共焦点顕微鏡で分析します。 個々のZスタック画像をつなぎ合わせ、共焦点顕微鏡を使用してフラットマウント角膜を画像化します。10倍対物レンズ、488 nmおよび561 nmレーザー、スライスあたり512ピクセル x 512ピクセルの解像度を非共振ガルバノスキャナーで使用します。 ImageJソフトウェアを使用して、CD31+ 血液およびLYVE-1+ リンパ管の密度を定量化します。 血管密度を決定するには、共焦点画像を 8 ビット画像に変換します。 プラグインから Vascular Density を選択します。 画像上の関心領域を選択し、[ OK]をクリックします。測定値が新しいデータウィンドウで開きます。 値をスプレッドシートファイルにコピーし、スチューデントのt検定を使用して、アルカリ焼けした眼球群と健康な眼球群の血管密度を統計的に比較します。注:CD31は、血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM-1)とも呼ばれ、血管新生に関与する細胞接着分子であり、初期および成熟血管の内皮細胞で高発現しています13。LYVE-1(リンパ管内皮ヒアルロン酸受容体-1)は、リンパ管内皮細胞上の細胞表面マーカーであり、リンパ管新生マーカーとして用いることができる14。