碱烧伤角膜新生血管化的小鼠模型

所有动物工作，包括实验程序和安乐死，均由贝勒医学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准，协议编号为 AN-8790。 1. 1 N NaOH的制备 将 4 mL 无菌去离子水加入 15 mL 离心管中。称出 400 毫克氢氧化钠 （NaOH），小心地加入试管中。 通过使用玻璃棒缓慢搅拌溶液来溶解NaOH。通过向试管中加入无菌去离子水，将体积补足至10mL，然后通过轻轻地上下倒置试管再次混合。盖紧盖子，将溶液储存在室温下。 每月准备新鲜溶液，因为吸收空气中二氧化碳的溶液可能会降低 NaOH 溶液的浓度。 使用前务必轻轻混合 NaOH 溶液。注意：在化学防护罩内准备溶液，并穿戴适当的个人防护装备 （PPE）。 2.4%多聚甲醛（PFA）溶液的制备 向玻璃烧杯中加入 30 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。称出 4 克多聚甲醛 （PFA），并将其加入烧杯中。 搅拌下将烧杯保持在60°C的热板上。滴加1N NaOH溶液以提高pH值，直到溶液澄清。 使用 1 N 盐酸 （HCl） 检查并将 pH 值调节至 7.4。用 1x PBS 将最终体积调节至 50 mL。 冷却并过滤溶液。将溶液储存在4°C。注意： 在通风橱中准备溶液，同时穿着适当的个人防护装备。 3. 准备氯胺酮/甲苯噻嗪鸡尾酒 通过将 0.8 mL 氯胺酮（原液浓度：100 mg/mL）和 0.16 mL 甲苯噻嗪（原液浓度：100 mg/mL）加入 9.4 mL 生理盐水中来制备氯胺酮/甲苯噻嗪混合物。 在室温 （RT） 下将混合物储存在无菌注射瓶中。 4.碱烧伤小鼠角膜 在手术前 30 分钟皮下注射美洛昔康（4-6 mg/kg 体重）以缓解疼痛。使用腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（氯胺酮80mg / kg和甲苯噻嗪16mg / kg体重）麻醉小鼠（C57BL / 6J，6-8周龄，雄性）。 通过捏住鼠标的脚趾来检查反射反应（踏板退出），并确认没有反射。在一只眼睛的角膜表面滴一滴局部麻醉剂，0.5%的丙美卡因，在另一只眼睛上滴一滴人工泪液。 使用 2 毫米活检打孔器，打出 Whatman 滤纸盘。 将 2 μL 1N NaOH 加入干净的培养皿中。将 2 mm 滤纸盘放在 1 N NaOH 液滴上，并使其浸泡 15 秒。 用镊子拿起滤纸，将滤纸涂在角膜中心的丙美卡因处理的眼睛上30秒。注意： 滤纸必须仅接触角膜中心，并且必须注意避免滤纸在放置后移动，因为移动滤纸会导致邻近组织灼伤。 在无菌注射器中用 20 mL 无菌盐水溶液冲洗眼睛。注意：必须注意确保彻底清洗角膜和结膜囊，以确保不会对角膜或周围组织造成进一步损害。清洗结膜囊将进一步预防眼睑。 使用一次性软湿巾轻轻擦拭眼睛和周围区域多余的盐水。之后，将小鼠保持在温暖的加热垫上的恢复笼中，直到可以走动。注：碱烧伤3天后每天监测小鼠。如果观察到疼痛或压力症状，则皮下注射美洛昔康（4-6mg / kg体重）。 5.新生血管渗入和混浊的检查和评估 在麻醉小鼠中，在烧伤后第10天在解剖显微镜下检查眼睛，并使用连接到解剖镜的相机获得图像以对混浊和新生血管进行评分。注意：带有摄像头的常规解剖镜就足够了。 在通过解剖显微镜观察角膜的同时，根据以下等级12 对烧伤后的不透明度进行评分：0 = 无不透明度;透明角膜1 = 轻度混浊;虹膜和瞳孔区域有轻微的朦胧感;虹膜和瞳孔清晰可见2 = 中度不透明度;虹膜和瞳孔几乎看不见3 = 严重混浊;虹膜或瞳孔不可见4 = 不透明角膜;虹膜和瞳孔不可见 在通过解剖显微镜观察角膜时，根据以下等级12 对 CoNV 进行评分：0 = 无新生血管形成;没有来自角膜缘的新血管1 = 轻度新生血管形成;源自角膜缘的新血管2 = 中度新生血管形成;血管起源于角膜缘，向角膜中心生长3 = 严重新生血管形成;起源于角膜缘并到达和/或穿过角膜中心的血管 使用学生 t 检验对碱烧伤和健康眼组之间的混浊和新生血管形成评分进行统计比较。 在第10天通过5%的异氟醚暴露对小鼠实施安乐死，直到呼吸停止后1分钟，然后进行颈椎脱位，并收集角膜进行平坦成像。 6. 光学相干断层扫描（OCT）成像 在烧伤后第10天拍摄麻醉小鼠眼睛前段的OCT图像。使用 IR + OCT 模式以 30° 视场和 100% IR 强度的 IR + OCT 模式以体积扫描形式执行 OCT 图像采集。 使用 ImageJ 软件量化角膜的厚度。 要测量厚度，请使用 ImageJ 软件中的 线选择 工具在中央角膜的前表面和后表面之间创建一条直线。 单击软件工具中的 “分析>测量 ”，将值传输到数据窗口。 将这些值复制到电子表格文件中，并使用学生 t 检验对碱烧伤和健康眼组之间的角膜厚度进行统计比较。注意：角膜的厚度是从角膜前表面的一点到角膜中心角膜后表面最近点的距离。 7. 扁平角膜上CoNV的免疫染色 在碱烧伤后第10天对小鼠实施安乐死，并通过钝性解剖摘除眼睛。 用拇指和食指拉开眼睑，将镊子放在眼球下方。关闭镊子，轻轻地将眼球从眼眶上拉开。 将眼球放入1x PBS中。对于每个眼球，首先在角膜缘区域下方用 30 G 针切开一个切口，从眼球上取下角膜。 用角膜微剪刀在角膜缘周围剪开，以切口为起点，慢慢将角膜和角膜缘与眼球分开。 使用细画笔轻轻清洁角膜以去除虹膜。将角膜固定在4%多聚甲醛中1小时。 在室温（RT）下在1x PBS中洗涤角膜三次，每次20分钟。 在室温下在封闭缓冲液（补充有0.1%Triton-X 100和5%牛血清白蛋白[BSA]的1x PBS）中孵育1小时。 将角膜转移到含有一抗的抗体溶液中。在补充有 1% BSA、0.1% Triton-X 100、Dylight550 偶联的抗 CD31 mAb （1：100） 和 Alexa Fluor488 偶联的抗 LYVE-1 mAb （1：100） 的 1x PBS 中制备抗体溶液。 在4°C孵育3天。 在1x PBS中洗涤角膜3次，每次20分钟。 在黑暗中使用Hoechst染色溶液（1：1,000）染色细胞核5分钟。 用径向切口压平角膜，并使用安装介质和盖玻片将它们安装在预先清洁的载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片，并在黑暗中干燥载玻片过夜，然后通过共聚焦显微镜进行分析。 通过拼接单个 Z 堆栈图像，使用共聚焦显微镜对平坦的角膜进行成像;在非共振振流扫描仪上使用 10 倍物镜、488 nm 和 561 nm 激光器，每层分辨率为 512 像素 x 512 像素。 使用 ImageJ 软件量化 CD31+ 血液和 LYVE-1+ 淋巴管的密度。 要确定血管密度，请将共聚焦图像转换为 8 位图像。 从插件中选择血管密度。 选择图像上的感兴趣区域，然后单击 “确定”。测量值将在新的数据窗口中打开。 将这些值复制到电子表格文件中，并使用学生 t 检验对碱烧伤和健康眼组之间的血管密度进行统计比较。注：CD31，也称为血小板内皮细胞粘附分子-1 （PECAM-1），是一种参与血管生成的细胞粘附分子，在早期和成熟血管的内皮细胞中高度表达13。LYVE-1（淋巴管内皮透明质酸受体-1）是淋巴内皮细胞上的细胞表面标志物，可用作淋巴管生成标志物14。