JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biotechnik

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

Published: January 12, 2024
doi:
10.3791/65258
, , , , , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,University of Rochester, 2Theodor Kocher Institute,University of Bern, 3Department of Biomedical Engineering,Rochester Institute of Technology

Summary

דוח זה מספק פרוטוקולים להרכבה, תרבית תאים ובדיקות על פלטפורמת μSiM לבניית מודלים של מחסום דם-מוח.

Abstract

ה-microSiM (μSiM) היא פלטפורמת תרבית מבוססת קרום למידול מחסום הדם-מוח (BBB). שלא כמו פלטפורמות קונבנציונליות מבוססות ממברנה, μSiM מספק לנסיינים יכולות חדשות, כולל דימות תאים חיים, איתות פרקריני ללא הפרעה בין חדרי ‘דם’ ו’מוח’, והיכולת לדמות ישירות אימונופלואורסצנטיות ללא צורך בחילוץ / הרכבה מחדש של ממברנות. כאן אנו מדגימים את השימוש הבסיסי בפלטפורמה כדי לבסס מודלים של מונוקולטורה (תאי אנדותל) ותרבית משותפת (תאי אנדותל ופריציטים) של BBB באמצעות ממברנות סיליקון-ניטריד ננו-נקבוביות אולטרה-דקות. אנו מדגימים תאימות הן עם תרביות תאים ראשוניות והן עם תרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC). אנו מספקים שיטות לניתוח איכותני של מודלים של BBB באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית ומדגימים את השימוש ב- μSiM להערכה כמותית של תפקוד מחסום בבדיקת חדירות של מולקולה קטנה. השיטות המסופקות אמורות לאפשר למשתמשים לבסס את מודלי המחסום שלהם על הפלטפורמה, ולקדם את השימוש בטכנולוגיית שבבי רקמות לחקר רקמות אנושיות.

Introduction

רקמות חיות ממודרות על ידי תאים מיוחדים היוצרים ומתחזקים מחסומים ומווסתים אילו תאים ומולקולות מועברים מתא אחד למשנהו. ויסות לא תקין של תפקודי מחסום יכול להיות המקור הן למחלות חריפות והן למחלות כרוניות. מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מחסום הרקמה המגביל ביותר בגוף האדם1. תפקוד לקוי של BBB עומד בבסיס מגוון רחב של מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כולל מחלת אלצהיימר2, מחלת פרקינסון3,4, וטרשת נפוצה 5,6. פגיעה ב- BBB קשורה גם לפגיעה קוגניטיבית ארוכת טווח כתוצאה של הפרעות אקוטיות, כגון אלח דם7, COVID-198 והזיה9 לאחר הניתוח. הפיתוח של תרופות בעלות פוטנציאל לטיפול בהפרעות מוחיות היה קשה באופן מתסכל בגלל האתגר של פריצה מכוונת של מחסום הדם-מוח כדי לספק מולקולות ביו-אקטיביות למטרות במוח10. מסיבות אלה, שיטות לחקר תפקוד BBB במבחנה הן בעלות חשיבות עליונה להבנה וטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית.

השיטות הבסיסיות למדידת תפקוד מחסום במבחנה כוללות הקמת חד-שכבה או תרבית משותפת על קרום חדיר למחצה ומדידת העמידות שמקנים התאים לדיפוזיה של מולקולות קטנות או לזרמים חשמליים קטנים11,12,13,14. בעוד הופעתן של מערכות מיקרופיזיולוגיות (MPS) הניבה שפע של אפשרויות למידול BBB בתלת-ממד15,16, המגוון של גיאומטריות המערכת מקשה על השוואת מדידות חדירות בין MPS או לערכי ספרות מבוססים. קביעת ערכי בסיס מהימנים חשובה במיוחד במחקר BBB שבו, בגלל ויסות המחסום הנרחב על ידי תאי אנדותל כלי דם במוח, ערכי חדירות במבחנה נבדקים היטב12,17,18. מסיבות אלה, מדידות חדירות על פני חד-שכבות שהוקמו על ממברנות דו-ממדיות יישארו מצרך עיקרי במחקרי BBB במשך שנים רבות. זה נכון לגבי מחסומי רקמות אחרים, כולל מחסומי אפיתל, שבהם ערכים מוחלטים של חדירות בסיסית משמשים כדי לאמת ולהשוות מודלים במבחנה 19,20,21.

במטרה להקים כלי חדש ובעל ערך עבור קהילת המחקר BBB, הצגנו22 וקידמנו 23,24,25,26 את מכשיר המיקרוהכולל פלטפורמת silicon membrane (μSiM) לשימוש במידול רקמת מחסום במהלך 5 השנים האחרונות. התכונה המאפשרת של הפלטפורמה היא קרום דק במיוחד (<100 ננומטר) עם מאות מיליוני ננו-נקבוביות 27,28 או תערובת של ננו-נקבוביות ומיקרו-נקבוביות29. שבבי הממברנה העצמאיים מיוצרים על ‘שבב’ סיליקון של 300 מיקרומטר המייצב את המבנים האולטרה-דקים30 ומאפשר לטפל בהם בפינצטה להרכבת מכשירים. בגלל אופיים האולטרה-דק, לממברנות יש חדירות גבוהה בשני סדרי גודל מזו של ממברנות רגילות חרוטות מסילה המשמשות בהתקני תרבית ממברנות מסחריים31,32. בפועל, משמעות הדבר היא שההפרעה של הממברנה לפיזור מולקולות קטנות מהננו-נקבוביות (<60 ננומטר) היא זניחה33. לכן, עבור מחסומים תאיים, רק התאים והמטריצות שהם מפקידים יקבעו את קצב המעבר של מולקולות קטנות מהתאים האפיקליים לתאי הבסיס המופרדים על ידי הממברנה34. עיצוב המכשיר והאופי האולטרה-דק של הממברנות מספקים גם יתרונות רבים למיקרוסקופיה אופטית. אלה כוללים 1) היכולת לעקוב אחר תרביות חיות באמצעות ניגודיות פאזה או הדמיית שדה בהיר, 2) היכולת להכתים ולצלם באופן פלואורסצנטי באתרו ללא צורך לחלץ ולהעביר את הממברנה לזכוכית כיסוי, ו -3) העובדה שהממברנות דקות יותר מ”פרוסות” קונפוקליות, כך שלתרביות משותפות ישירות יש מרווח טבעי יותר בין סוגי תאים מאשר ניתן להשיג עם ממברנות עקובות בעובי 6-10 מיקרומטר.

לאחרונה, קידמנו את הפלטפורמה לפורמט מודולרי כדי להקל על הרכבה מהירה34 והתאמה אישית35,36. מינפנו את הפורמט המודולרי כדי להפיץ רכיבי התקנים בין ההנדסה הביולוגית שלנו לבין מעבדות מחסום המוח המשתפות פעולה. לאחר מכן פיתחנו במשותף פרוטוקולים להרכבת מכשירים, מונוקולטורה ותרבית משותפת, צביעה אימונופלואורסצנטית וחדירות מולקולות קטנות והראינו ששיטות אלה ניתנות לשחזור בין מעבדות. באמצעות פרוטוקולים אלה, הראינו גם כי הפלטפורמה המודולרית תומכת ב-BBB מאומת שפותח באמצעות שיטת תרבית אנדותל מורחבת (EECM) ליצירת תאי אנדותל דמויי כלי דם במוח (BMEC) מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs)37. מטרת הדו”ח הנוכחי היא לסקור שיטות אלה בפירוט רב יותר, ובעזרת הסרטון הנלווה, לאפשר אימוץ רחב יותר של הפלטפורמה בקהילת BBB.

Protocol

1. הרכבת התקן μSiM הערה: שיטה זו מתארת את הרכבה של ההתקנים. לשבב הממברנה יש צד תעלה וצד שטוח, אשר ניתן להרכיב תעלה למעלה או תעלה למטה. התקני תעלות למטה משמשים בדרך כלל לתרבית תאים. בסביבה סטרילית (כלומר, מכסה מנוע בטיחות ביולוגית), הכינו את כל החומרים להרכבה, כולל גופי ההרכבה, הרכיבים, שבבי הממברנה והפינצטה. הניחו את שבב הממברנה על מרכז גוף התאורה A1 באמצעות פינצטה שבב. המשטח השטוח של השבב פונה כלפי מטה ואזור התעלה פונה כלפי מעלה עבור התקני תעלות, ולהיפך עבור התקני תעלות.הערה: שלבי ההרכבה הבאים מודגמים על ידי שימוש במכשיר התעלה למטה כדוגמה, המאפשר אזור צמיחה שטוח בתא העליון. רכיב אג”ח 1 לשבב. ראשית, קלפו את שכבות ההגנה הכחולות משני צידי רכיב 1 באמצעות פינצטה ישרה והניחו אותה בגוף התאורה A1, בתא העליון כלפי מטה. לחץ בעדינות על רכיב 1 כלפי מטה עד שהדבק הרגיש ללחץ (PSA) נוגע בשבב. הניחו את גוף התאורה A2 על גוף התאורה A1 והפעילו לחץ חזק בפינות שונות כדי להבטיח התאמה הדוקה של השבב והרכיב.הערה: הקפד לא להסיר את שכבת ה- PSA. זוהי שכבה שקופה ונוקשה יותר בהשוואה לשכבות המגן הכחולות. רכיב אג”ח 2 לרכיב 1 עם השבב. ראשית, הכינו את רכיב 2 על ידי תפיסת פינה אחת של רכיב 2 בפינצטה ישרה וקילפו מהסדין. לאחר מכן, תפסו את אזור “המשולש” שאינו PSA של רכיב 2 ויחד הסירו את שכבת ההגנה העבה והשקופה ואת השכבה הכחולה של רכיב 2, וחשפו את משטח ה-PSA. מניחים את רכיב 2 במתקן B1, PSA בצד כלפי מעלה. מניחים את רכיב 1 עם שבב הממברנה במתקן B1, כאשר התא העליון פונה כלפי מעלה. הניחו את גוף התאורה B2 על רכיב 1 והפעילו לחץ יציב בפינות שונות של גוף התאורה B2. הוציאו את המכשיר המורכב מהמתקן והשתמשו בפינצטה ישרה כדי ללחוץ על כל בועות האוויר בחלק התחתון של המכשיר ולאטום את קצוות התעלה, תוך הימנעות ממגע עם אזור הממברנה. לפני השימוש לתרבית תאים, אולטרה סגול (UV) – לעקר התקנים שהורכבו לאחרונה במשך 20 דקות. 2. תרבית תאים הערה: שיטה זו מתארת פרוטוקולים עבור תרביות ראשוניות ותרביות הנגזרות מ-hiPSC בפלטפורמה. השיטות מתארות מונוקולטורה של תאי אנדותל בתא העליון של המכשיר ותרבית משותפת של פריציטים ותאי אנדותל עם פריציטים בתא התחתון ותאי אנדותל בתא העליון של התקנים שהורכבו בתעלות למטה. למידות התא ולאמצעי אחסון, ראו טבלה 1. אלה הם הפורמטים הנפוצים ביותר; עם זאת, ניתן להשתמש בפריסות אחרות של תרביות תאים בהתאם לצרכי המשתמש. הכנת תא תרבית תאיםלהרכיב את המכשירים בהתאם לפרוטוקול המפורט בסעיף 1. הניחו את המכשירים במהדקי צינורות סטריליים. לפני תרבית תאים, לעקר את מלחציים על ידי השרייתם אתנול במשך ≥20 דקות. יש לעקר מחדש לאחר כל ניסוי לשימוש חוזר. תרבית את המכשירים בצלחת פטרי סטרילית גדולה. ללחות נוספת, הוסיפו צלחת פטרי קטנה או מכסה צינור חרוטי בנפח 50 מ”ל מלא במים סטריליים. לשטוף את החדר העליון של המכשירים פעמיים עם 100 μL של מים סטריליים. לתרבית תאים בתא התחתון, שטפו את החדר התחתון עם 20 מיקרוליטר מים סטריליים. מונוקולטורה של קו תאים hCMEC/D3 (BBB)הכינו את תא תרבית התאים לפי סעיף 2.1. מצפים את התאים העליונים ב-25 מיקרוגרם/ס”מ, 2 קולגן I ו-5 מיקרוגרם/ס”מ,2 פיברונקטין אנושי מעורבב במי מלח חוצצי פוספט (PBS). תן לו לשבת במשך 1-2 שעות ב 37 °C (75 °F) או לילה ב 4 °C (75 °F). הסר את תמיסת הציפוי והוסף 100 μL של תווך אנדותל מחומם מראש (מדיום Assay) לתא העליון ו- 20 μL לתא התחתון. כדי להכין את מדיום המבחן, לערבב 100 מ”ל של מדיום בסיסי אנדותל + 400 μL של גורם גדילה פיברובלסטי אנושי + 40 μL של הידרוקורטיזון + 100 μL של גנטמיצין סולפט + 2 מ”ל של סרום בקר עוברי. מעבר תאי hCMEC/D3 בהתאם לפרוטוקול היצרן; טריפסיניזציה של התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות ולאחר מכן הפסקת טריפסיניזציה על ידי תוספת של תווך אנדותל שחומם מראש. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשהות מחדש את גלולת התא במדיית בדיקה ולזרוע את התאים בתאים העליונים בצפיפות של 40,000-60,000 תאים לסמ”ק2. יש לדגור על המכשירים בטמפרטורה של 37°C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO 2) למשך2-4 שעות כדי להקל על הידבקות התא. לדוגמה, כדי להשיג 40,000 תאים/ס”מ2 על שבב2 0.37 ס”מ, הוסף 100 μL של תמיסת תא עם ריכוז של 150,000 תאים/מ”ל לתא העליון.הערה: אנו מתרבתים ומעבירים hCMEC/D3 על פי Hudecz et al.38, תוך שימוש בנוסחה שונה של מדיה גדילה אנדותלית-2 (EGM-2) לתחזוקת תאים ו”מדיום בדיקה” מופחת גורם גדילה לאחר תת-תרבית למבחנים. נוסחאות מדיה אחרות צריכות להיות תואמות להתקנים, אם כי אנו ממליצים על נוסחאות המדיה של Hudecz et al.38 אם משתמשים נתקלים בבעיות עם הישרדות hCMEC/D3. לאחר 2-4 שעות להידבקות תאים, החליפו עם מדיום בדיקה טרי בשני התאים כדי להסיר תאים מתים או לא מחוברים. שמור על המכשירים ב 37 ° C עם 5% CO 2, החלפת מדיום הבדיקה בשני החדרים כל2-3 ימים עד הניסוי. בדיקות מבוצעות בדרך כלל לאחר שבועיים של תרבית. מונוקולטורה של תאים דמויי EECM-BMEC הנגזרים מ-hiPSCהכינו את תא תרבית התאים לפי סעיף 2.1. הכינו קולגן IV מתמיסת שליה אנושית על ידי הוספת 5 מ”ל של 0.5 מ”ג/מ”ל חומצה אצטית ל-5 מ”ג קולגן IV ליצירת תמיסה של 1 מ”ג/מ”ל. תן לתמיסה לשבת במשך ≥4 שעות ב 4 ° C כדי לשחזר באופן מלא. הפתרון יציב ב 4 ° C במשך 2 שבועות. צפו את התאים העליונים ב-100 מיקרוליטר ביחס של 4:1:5 קולגן IV, פיברונקטין בקר ומים סטריליים. מעיל ב 37 ° C במשך 2-4 שעות. הסר את תמיסת הציפוי והוסף 100 μL של hECSR בטמפרטורת החדר לתא העליון ו- 20 μL לתא התחתון. מעבר תאים דמויי EECM-BMEC על פי Nishihara et al.37; מוסיפים תערובת אנזימים לפירוק תאים לתאים ומעבירים לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 5-8 דקות. Pipet את הפתרון התא כדי יחיד ולהוסיף עד פי 4 נפח של תווך אנדותל בצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר; להשהות מחדש את התאים ב-hECSR ולזרוע בתאים העליונים בצפיפות של 40,000 תאים לסמ”ק2. לדגור על המכשירים ב 37 ° C עם 5% CO 2 במשך2-4 שעות כדי להקל על הידבקות התא. לדוגמה, כדי להשיג 40,000 תאים/ס”מ2, הוסף 100 μL של תמיסת תאים ב-150,000 תאים/מ”ל. לאחר 2-4 שעות להידבקות תאים, החליפו עם hECSR טרי בשני התאים כדי להסיר תאים מתים או לא מחוברים. שמור על המכשירים ב 37 ° C עם 5% CO 2, החלפת hECSR בשני התאים כל1-2 ימים עד הניסוי. בדיקות מבוצעות בדרך כלל ביום 6 של התרבות. hCMEC/D3 ותרבית משותפת ראשונית של פריציט כלי דם במוח האדם (HBVP)לפני הרכבת המכשיר, צפה את שבבי הממברנה עם 2 מיקרוגרם / ס”מ2 של פולי-L-ליזין (PLL) מעורבב PBS. יש למרוח 50-80 μL PLL בטיפה רק לצד שיפנה כלפי מטה במכלול המכשיר הסופי. השלימו את תהליך הציפוי תוך 1-2 שעות ב-37°C או למשך הלילה ב-4°C. הסירו את תמיסת הציפוי. שטפו את שבבי הממברנה במים סטריליים טהורים במיוחד ואפשרו להם להתייבש. הרכיבו את המכשירים בהתאם לפרוטוקול המפורט בסעיף 1 לעיל, כאשר הצד המצופה PLL פונה כלפי מטה, והכינו את תא תרבית התאים בהתאם לסעיף 2.1. מצפים את התאים העליונים לפי סעיף 2.2.2. הוסף 50 μL של מדיום פריציט שחומם מראש לתאים העליונים והוסף 20 μL לתעלות התחתונות. מעבר HBVPs בהתאם לפרוטוקול היצרן; טריפסיניזציה של התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות, ואז להפסיק את הטריפסיניזציה על ידי תוספת של מדיום פריציטים שחומם מראש. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה בטמפרטורה של 200 × למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מרחפים מחדש את גלולת התא בתווך פריציטים וזורעים את התאים בחדרים התחתונים בצפיפות של 14,000-25,000 תאים לסמ”ק2. הפוך את המכשירים אך שמור על ממשק אוויר עם התאים העליונים כדי להקל על חילופי גזים.הערה: ניתן להשיג את ממשק האוויר הנדרש במהלך ההיפוך על ידי היפוך המכשירים לאחר הנחתם בתוך מהדקי צינורות ודחיפה כלפי מטה בכל הפינות לפני ההיפוך, או על ידי הנחת המכשירים הפוכים על רצועות מקבילות של אקריליק או סיליקון במרווחים מספיק רחוקים זה מזה כדי לשמור על התאים העליונים ללא הפרעה. ייתכן שיהיה צורך למטב את צפיפות הזריעה עבור כל משתמש. כדי להשיג 14,000 תאים לסמ”ק2, הוסף 20 μL של תרחיף תאים ב~590,000 תאים / מ”ל. שימו לב ש-20 μL מוכנס לתא התחתון כדי למנוע בועות, אך הצפיפות מחושבת באמצעות נפח התא התחתון של 10 μL. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2 במשך2-4 שעות במצב הפוך כדי להקל על הידבקות התא. לאחר 2-4 שעות להידבקות תאים, הפוך את המכשירים זקופים והחלף אותם בתווך פריציטים טרי בשני החדרים כדי להסיר תאים מתים או לא מחוברים. לאחר זריעת פריציט, זרע hCMEC/D3s בתא העליון, לאחר שלבים 2.2.4-2.2.5. העבר את שני החדרים למדיום הבדיקה. שמור על המכשירים ב 37 ° C עם 5% CO 2, החלפת מדיום הבדיקה בשני התאים כל1-2 ימים עד הניסוי. תרבית תאים ראשונית נשמרת בדרך כלל במשך 6-8 ימים לפני הבדיקה.הערה: אם המונוקולטורה של HBVP תושווה למונוקולטורה של hCMEC/D3 או לתרביות משותפות של hCMEC/D3 ו-HBVP, אז החליפו מדיום פריציטים עם מדיום בדיקה 2-3 ימים לאחר זריעת ה-HBVPs. תרבית משותפת של תאים דמויי EECM-BMEC ותאים דמויי פריציט במוח (BPLC) הנגזרים מ-hiPSCהכינו את תא תרבית התאים לפי סעיף 2.1 וציפו את התאים העליונים לפי שלבים 2.3.2-2.3.3. הסר את תמיסת הציפוי והוסף 50 μL של סרום בקר עוברי בטמפרטורת החדר Essential 6 בינוני + 10% עוברי (E6 + 10% FBS) לתא העליון. מעבר BPLCs על פי Gastfriend et al.39; מוסיפים תערובת אנזימים לניתוק תאים לתאים ומעבירים לאינקובטור של 37°C למשך 5-15 דקות, עד ש~90% מהתאים מעוגלים. Pipet את תמיסת התא כדי סינגולריזציה ולהוסיף נפח גדול פי 4 של DMEM/F12 בצינור צנטריפוגה של 50 מ”ל, באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לסנן ולסנכרן את התאים באופן מלא. מעבירים לצינור צנטריפוגה 15 מ”ל, צנטריפוגה ב 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, מרחפים מחדש את גלולת התא ב E6 + 10% FBS, וזרעו את התאים בתאים התחתונים בצפיפות של 14,000-25,000 תאים לסמ”ק2. הפוך את המכשירים אך שמור על ממשק אוויר עם התא העליון כדי להקל על חילופי גזים.הערה: ניתן להשיג את ממשק האוויר הנדרש במהלך היפוך המכשירים לאחר הנחתם בתוך מהדקי הצינור ודחיפה כלפי מטה בכל הפינות לפני ההיפוך, או על ידי הנחת המכשירים הפוכים על רצועות מקבילות של אקריליק או סיליקון במרווחים מספיק רחוקים זה מזה כדי לשמור על התאים העליונים ללא הפרעה. ייתכן שיהיה צורך למטב את צפיפות הזריעה עבור כל משתמש. כדי להשיג 14,000 תאים לסמ”ק2, הוסף 20 μL של תרחיף תאים ב~590,000 תאים / מ”ל. שימו לב ש-20 μL מוכנס לתא התחתון כדי למנוע בועות, אך הצפיפות מחושבת באמצעות נפח התא התחתון של 10 μL. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2 במשך2-4 שעות במצב הפוך כדי להקל על הידבקות התא. לאחר 2-4 שעות להידבקות תאים, הפוך את המכשירים זקופים והחלף עם E6 טרי + 10% FBS בשני החדרים כדי להסיר תאים מתים או לא מחוברים. יום לאחר זריעת פריציט, זרעו תאים דמויי EECM-BMEC בתא העליון, בעקבות שלבים 2.3.5-2.3.6. העבר את שני התאים ל- hECSR. שמור על המכשירים ב 37 ° C עם 5% CO 2, החלפת מדיום הבדיקה בשני החדרים כל1-2 ימים עד הניסוי. תרבית משותפת שמקורה ב-hiPSC נשמרת בדרך כלל במשך 7 ימים עבור BPLCs ו-6 ימים עבור תאים דמויי EECM-BMEC לפני הבדיקות.הערה: אם מונוקולטורה BPLC יושוו מונוקולטורה EECM-BMEC או EECM-BMEC ותרבויות משותפות BPLC, ולאחר מכן להחליף E6 + 10% FBS עם hECSR 1 יום לאחר זריעת BPLCs. 3. אימונוציטוכימיה הערה: שיטה זו מתארת פרוטוקול לצביעה אימונוציטוכימית והדמיה של תאים בתרבית בצד העליון ו/או התחתון של הממברנה. מטרת ניסוי זה היא לקבוע את נוכחותם ומיקומם של חלבוני מפתח שיש למצוא ב-BBB, כגון חלבוני דבק וצומת הדוק, וחלבוני זהות התא. שיטות צביעה חלופיות וחיות תואמות גם הן לפלטפורמה. קיבוע והכתמה על המכשיריםהניחו את הנוגדנים העיקריים על קרח כדי להפשיר. הכינו תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורת החדר (למשל, דללו 16% PFA בנפח פי 3 של PBS) או צננו 100% מתנול ב-20°C-. יצירת פתרון חסימה מתאים לפי טבלה 2. יש לאחסן על קרח.הערה: ייתכן שיהיה צורך בוורטקס הפתרון כדי להמיס לחלוטין את Triton X-100. תקן את התאים על ידי pipeting 20 μL של קיבוע (למשל, PFA או מתנול) לתוך החדר התחתון ו 50 μL לתוך החדר העליון. יש לדגור על המכשירים למשך 10 דקות (PFA) או 2 דקות (מתנול) בטמפרטורת החדר. יש לשטוף במשך 3 x 5 דקות על-ידי החדרת 20 μL של PBS דרך החדר התחתון ו-100 μL לתוך התא העליון. חסום למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על ידי הוספת 20 μL של תמיסת החסימה לתא התחתון ו- 50 μL של תמיסת חסימה לתא העליון. בדוק אם יש בועות בתא התחתון. הכינו את תמיסת הנוגדנים הראשונית על ידי דילול הנוגדנים בתמיסת החסימה לפי טבלה 2. יש לאחסן על קרח. צביעה עם הנוגדנים הראשוניים על ידי הוספת 20 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית לתא התחתון והחלפת נפח התא העליון עם 50 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית. בדוק אם יש בועות בתא התחתון. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף במשך 3 x 5 דקות על-ידי החדרת 20 μL של PBS דרך החדר התחתון ו-100 μL לתוך התא העליון. הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית על ידי דילול הנוגדנים בתמיסת החסימה לפי טבלה 2. יש לאחסן על קרח המוגן מפני אור. צביעה עם נוגדנים משניים על ידי הוספת 20 μL של תמיסת נוגדנים משנית לתא התחתון והחלפת נפח התא העליון עם 50 μL של תמיסת נוגדנים משנית. בדוק אם יש בועות בתא התחתון. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כשהיא מוגנת מפני אור. יש לשטוף במשך 3 x 5 דקות על-ידי החדרת 20 μL של PBS דרך החדר התחתון ו-100 μL לתוך התא העליון. הכינו תמיסת כתם גרעיני. לדלל את Hoechst 1:10,000 ב-PBS. הוסף 20 μL של תמיסת הכתם הגרעיני לתא התחתון והחלף את נפח התא העליון ב- 50 μL של תמיסת הכתם הגרעיני. בדוק אם יש בועות בתא התחתון. יש לדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. הסר את הכתם על ידי הוספת 20 μL של PBS לתא התחתון והחלפת נפח החדר העליון עם 100 μL של PBS. דמיינו את המכשירים מיד או אחסנו אותם בטמפרטורה של 4°C כאשר צלחת הפטרי עטופה בפרפילם ומוגנת מפני אור עד שהיא מוכנה להדמיה. הדמיה קונפוקליתהערה: סעיף זה מתאר הדמיה של המכשירים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב הפוך עם מרחק עבודה ארוך (LWD) 40x אובייקטיבי (מים, WD 590-610, צמצם מספרי 1.15) כדוגמה. לקבלת מרחקי עבודה ותאימות עדשות, עיין בחומר משלים ב- McCloskey et al.34. תמונות של כל אזור הממברנה מצולמות גם באמצעות מטרה של 10x כדי להבטיח שתמונות 40x מייצגות את השדה כולו. אלה נלקחים בדרך כלל בשדה רחב.הפעל את המיקרוסקופ ופתח את תוכנת ההדמיה. הגדר את התעלות בהתאם לתכונות הנוגדן המשני והכתם הגרעיני, באמצעות מצב הדמיה קונפוקלית. מטב את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה כדי להבטיח שהאות נמצא מעל הרקע ומפחית את תוצרי ההדמיה.עבור צביעה גרעינית Hoechst, השתמש עירור 405, פליטה 450/50 Bandpass (BP), 500 ms זמן חשיפה, 50% כוח לייזר. עבור תוויות המשתמשות בנוגדן משני מצומד ל-Alexa Fluor (AF) 488, השתמש בעירור 488, פליטה 525/50BP, זמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה ועוצמת לייזר של 50%. עבור תוויות המשתמשות בנוגדן משני מצומד ל-AF568, יש להשתמש בעירור 561, פליטה 600/50BP, זמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה ועוצמת לייזר של 100%. הניחו את המכשיר במחזיק התקן השקופיות של המיקרוסקופ, בתא העליון הפונה כלפי מעלה וקבעו במיקרוסקופ באמצעות מחזיק שקופיות במיקרוסקופ. הפעל שידור חי ובחר את הערוץ עבור הכתם הגרעיני. מצאו את הממברנה באמצעות מטרה נמוכה, וודאו שאזור קרום הסיליקון-ניטריד השקוף ממורכז, מכיוון שהאור לא יעבור דרך אזור הסיליקון הכחול והמוצק. לאחר שהמכשיר ממורכז כראוי ושכבת התא נמצאת, עברו למטרה 40x, הרטיבו את המטרה והתמקדו באזור הממברנה באמצעות הכתם הגרעיני כמנחה. הפעל הדמיה של מחסנית z והגדר את מצב סריקה להתחלה/סיום. הגדר גודל צעד או ספירה. באמצעות ידית הכוונון הגסה במיקרוסקופ, כוונו את תחילת הסריקה לחלק העליון של שכבת תאי האנדותל, תוך שימוש בכתם הגרעיני כמנחה, וסרקו את קצה הסריקה בתחתית שכבת הפריציטים, תוך שימוש בכתם הגרעיני כמנחה. בדוק את כל הערוצים כדי לוודא שהכל יילכד בשדה ההדמיה.הערה: בדרך כלל אנו משתמשים בשלב אוטומטי, שהוא ~ פרוסות 0.2 מיקרומטר. הגדר את שם התמונה ולחץ על Acquisition כדי להתחיל בהדמיה. חזור על הפעולה באזורים שונים לפי הצורך. עבד את התמונות הקונפוקליות באמצעות ImageJ40 או Imaris.כדי לעבד ב- Imaris, גרור את קובץ התמונה לתוכנית כדי לפתוח. בחר Section בשורת התפריטים העליונה כדי לראות תמונה דו-ממדית של מישור x-y עם תצוגות תואמות של המישורים x-z ו- y-z. בחר תצוגת תלת-ממד בשורת התפריטים העליונה כדי לראות תמונת תלת-ממד. לחץ על התמונה וגרור אותה כדי לסובב. בחרו ‘ תצלום בזק’ בשורת התפריטים העליונה כדי לצלם תמונה. 4. בדיקת דגימה של חדירות מולקולות קטנות הערה: סעיף זה מתאר מתודולוגיה למדידות כמותיות של תכונות מחסום של תרביות תאים. מטרת הניסוי היא לאתר ריכוז של מולקולה פלואורסצנטית קטנה שעוברת דרך שכבות התא ונכנסת לחדר התחתון של הפלטפורמה. נתונים אלה משמשים לאחר מכן לחישוב חדירות תאית. טכניקת דגימהלהרכיב את המכשירים בהתאם לפרוטוקול המפורט בסעיף 1 ולתרבית את קווי התאים הרצויים כמתואר בסעיף 2. כלול התקן נוסף שישמש כהתקן בקרה מצופה ללא תאים למדידת חדירות המערכת.הערה: מומלץ לפחות שלושה עותקים טכניים משוכפלים לכל תנאי; עם זאת, נדרש רק שכפול אחד של הפקד המצופה. לפני תחילת בדיקת הדגימה, החלף את המדיום בתא התחתון בתווך טרי. בדוק את המפגש של monolayer האנדותל בכל מכשיר מתחת למיקרוסקופ. שימו לב לרווחים בחד-שכבות התא, מכיוון שזה ישפיע על פיזור הצבע לחדר התחתון.הערה: תרבית אנדותל בריאה צריכה להיות 100% קונפלוקטיבית. הכינו את תמיסת המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית (למשל, 150 מיקרוגרם/מ”ל לוציפר צהוב, 457 Da) בתווך תרבית תאים. הכינו נפח עודף של תמיסת המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית שתשמש להכנת התמיסות הסטנדרטיות המשמשות כהפניות לחישוב ריכוז המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית שנדגמה מהתעלה התחתונה.הערה: אנו ממליצים להכין 400 μL של תמיסה עודפת לשימוש כתמיסה סטנדרטית עם הריכוז הגבוה ביותר של מולקולה קטנה פלואורסצנטית. החלף את המדיום בבאר העליונה עם 100 μL של תמיסת מולקולה קטנה פלואורסצנטית.הערה: אנו ממליצים להשתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגולים סביב יציאות הדגימה ולהמתין עד שהדיו ההידרופובי יתייבש לחלוטין לפני הוספת תמיסת צבע פלואורסצנטי. פעולה זו מונעת את התפשטות התווך מהערוץ התחתון סביב יציאת הדגימה בשלב 4.1.7. אנו ממליצים להוסיף את תמיסת המולקולות הקטנות הפלואורסצנטיות למשטח העליון היטב, להמתין 2 דקות לפני הוספת התמיסה הפלואורסצנטית למכשיר הבא, או לעבוד בקבוצות של 3 (להוסיף את התמיסה לשלושה מכשירים בו זמנית ולהמתין 5 דקות כדי להוסיף את שלושת המכשירים הבאים). לדגור על המכשירים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 1 שעות. במהלך דגירה של שעה אחת בשלב הקודם, הכינו תמיסות סטנדרטיות על ידי ביצוע דילולים טוריים פי 2 מתמיסת המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית שהוכנה בשלב 4.1.3. פיפט 50 μL של כל תמיסה לתוך צלחת שחורה שטוחה 96 בארות בטריפליקטים. השתמש בתווך תרבית תאים ריקים כפתרון הסטנדרטי הבסיסי.הערה: כדי להכין תמיסות סטנדרטיות, אנו ממליצים על 11 דילולים סדרתיים בנפח סופי של 200 μL ועל שימוש בתווך תרבית תאים ריק כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנט הבסיסית.מעבירים 200 μL של 400 μL של תמיסת המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית העודפת שהוכנה בשלב 4.1.3 לתוך צינור המכיל 200 μL של תווך, מערבבים היטב, ומעבירים 200 μL של תמיסה זו לצינור הבא המכיל 200 μL של תווך. חזור על דילול 1:2 עד לקבלת 10 צינורות בסך הכל. פיפט 50 μL של התמיסה הסטנדרטית המרוכזת ביותר לעמודה 1 בטריפליקטים בלוח 96 בארות (B1, C1, D1), התמיסה השנייההמרוכזת ביותר לעמודה 2 (B2, C2, D2), וכן הלאה. עבור העמודהה-12 בלוח, צינור 50 μL של מדיה ריקה בטריפליקטים (B12, C12, D12). בצע את השלבים הבאים כדי לדגום את תמיסת המולקולות הקטנות הפלואורסצנטיות מהתעלה התחתונה.הסר את תמיסת המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית מהבאר כדי לעצור את תהליך הדיפוזיה. הניחו קצה המכיל 50 μL של מדיום לתוך היציאה העליונה כדי לשמש כמאגר על ידי החדרת הקצה עם 50 μL לתוך היציאה, הרמת המכשיר, ופליטה עדינה של הקצה תוך אחיזה בחלק העליון לייצוב. הגדר את ההתקן. ודאו שאין בועות בקצה הפיפט או באוויר בקצה הפיפט כדי למנוע הוספת בועות לתא התחתון במהלך הדגימה. הוסף 50 μL של בינוני לתוך הבאר העליונה כדי למנוע הפרעה של monolayer התא במהלך הדגימה. לדגימת התמיסה מהתעלה התחתונה, דחפו צינור עם קצה פיפט ריק להתנגדותו הראשונה, הכניסו את החוד ליציאת הדגימה, והפכו את הצינור 50 מיקרוליטר של התמיסה מהתעלה התחתונה. מעבירים ישירות לצלחת שחורה בעלת תחתית שטוחה בעלת 96 בארות המכילה את הפתרונות הסטנדרטיים.הערה: מומלץ לבדוק את שכבת התא מתחת למיקרוסקופ מיד לאחר הדגימה. ציור מדיה מהערוץ התחתון עלול לגרום מדי פעם להפרעה בשכבת התא בבאר העליונה, מה שעלול לגרום למדידות חדירות לא עקביות. עבודה מהירה לאורך השלבים ב- 4.1.7 תסייע למנוע זאת. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בקורא מיקרו-צלחות באמצעות הפרמטרים המתאימים של אורך גל עירור ופליטה עבור המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית שבה נעשה שימוש. עבור Lucifer Yellow, השתמש בעירור של 428 ננומטר ופליטה של 536 ננומטר, עם רווח אופטימלי. פלואורסצנטיות נמדדת מראש הצלחת. הוסף את הצלחת לקורא הלוחות, סמן את הבארות באמצעות דוגמה (כולל העקומה הסטנדרטית) ובחר התחל כדי לקרוא את הצלחת. חישוב ערך החדירות (ראה קובץ משלים 1 לתבנית)הפחת את ערך עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של התווך הריק מכל ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות שנמדדו. השתמש במשוואה (1) כדי לחשב את חדירות המערכת Ps:(1)כאשר [A]A הוא ריכוז המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית שנאספה מהתעלה התחתונה, V הוא הנפח שנדגם ונוסף ללוח (0.050 מ”ל), [A]L הוא ריכוז המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית שנוספה לבאר העליונה (למשל 0.15 מ”ג/מ”ל), t הוא זמן הדגירה (ב-s או בדקה בהתאם ליחידות הרצויות), ו- S הוא שטח הפנים של הממברנה (0.014 ס”מ2).חישוב [A]A באמצעות המשוואה המתקבלת על ידי שרטוט עקומה סטנדרטית מיציאות עוצמת הפלואורסצנטיות והריכוזים הידועים של התמיסות הסטנדרטיות. חשב ריכוזים (x) של דגימות הניסוי על ידי הכנסת ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות שלהם (y) למשוואה.הערה: השתמש בחלק של העקומה הסטנדרטית שהוא ליניארי. אנו ממליצים למדוד את שטח הפנים של הממברנה מתמונה של הממברנה שצולמה תחת המיקרוסקופ מכיוון ששטח הממברנה יכול להשתנות בהתאם למספר הלוט ועשוי להשפיע באופן משמעותי על ערכי החדירות המחושבים אם הם שונים מהבקרה המצופה. השתמש במשוואה (2) כדי לחשב את החדירות של חד-שכבת התא Pe:(2)כאשר PS היא חדירות המערכת כפי שחושבה בשלב 4.2.2 ו- PC הוא ערך חדירות המערכת של התקן הבקרה המצופה ללא תאים.

Representative Results

ההרכבה של התקן תעלות למטה מוצגת באיור 1. גופי התאורה מנחים את הרכבת הרכיבים ואת שבב הממברנה. רכיב 1 הוא בעיקר אקריליק עם משטח PSA לחיבור לשבב ופתח לתא התחתון ויציאות לגישה לצנרת לתא התחתון. רכיב 2 הוא שכבת הערוץ ומכיל “משולש” לא דביק, ללא PSA בפינה הימנית העליונה לאחיזה. התקני תעלות למטה מספקים אזור גידול תרבית תאים שטוחה בתא העליון, בעוד שלמכשירי תעלה יש משטח שטוח לתרבית תאים בתא התחתון. ביצענו מונוקולטורות אנדותל ותרביות משותפות של hCMEC/D3 ו-HBVPs ושל תאים דמויי BPLC שמקורם ב-hiPSC IMR90-4 ורכשנו תמונות פאזה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה Nikon Eclipse Ts2 ומטרה 10x (איור 2). צפיפות זריעה אופטימלית עבור תרבית תאים ראשונית מוצגת (תמונות שצולמו יום אחד לאחר הזריעה), כמו גם HBVPs עם תת-זרעים (איור 2A). תמונות סופיות של שלב החקלאות המשותפת והמונוקולטורה (6 ימים של תרבית תאי אנדותל) יכולות להיות קשות להבחנה (איור 2C), ואישור של תרבית משותפת ראשונית מוצלחת עשוי לדרוש צביעה אימונופלואורסצנטית (ראו פרוטוקול סעיף 3). מודגמות גם צפיפות זריעת BPLC נמוכה, גבוהה ואופטימלית שמקורה ב-hiPSC (איור 2B). ברור יותר להבחין בתרביות משותפות שמקורן ב-hiPSC בדימות ניגודיות פאזה בהשוואה לתרביות משותפות ראשוניות (איור 2D). זריעה נמוכה של BPLC גורמת לכיסוי פריציטים לקוי ולהתגבשות פריציטים, בעוד שזריעה גורמת לשכבת הפריציטים להתקלף מהממברנה. יתר על כן, החלפת המדיום בחדר התחתון מהר מדי עלולה לגרום לאובדן פריציט, שכן תאים אלה רגישים מאוד לגזירה. כיסוי אופטימלי על ידי פריציטים הוא ~90% עבור מודל BBB, ללא רווחים בשכבת האנדותל. תמונות מייצגות של תרבית משותפת שמקורה ב-hiPSC ממערכת החיסון מודגמות באיור 3 (6 ימים של תרבית תאי אנדותל). BPLCs שמקורם ב-IMR90-4 הוכתמו עבור סמן הפריציטים PDGFRβ, ותאים דמויי EECM-BMEC שמקורם ב-IMR90-4 הוכתמו עבור סמן צומת הדבקים VE-cadherin. הוכסט שימש להכתמת הגרעינים. התמונות נרכשו במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב באמצעות מטרה LWD 40x עם פרוסות 0.2 מיקרומטר ועובדו עם Imaris. ניתן להמחיש את שתי שכבות התא למרות שהננומברנה הדקה אינה נראית. ביצענו את בדיקת החדירות של מולקולות קטנות המבוססת על דגימה תוך שימוש באותם תנאי ניסוי בשתי מעבדות מרוחקות פיזית באוניברסיטת ברן, שוויץ, ובאוניברסיטת רוצ’סטר, ניו יורק, ארה”ב כדי להדגים שחזור בין-מעבדתי של תוצאות (איור 4)34. תאים דמויי EECM-BMEC שמקורם ב-hiPSC IMR90-4 גודלו בתרבית במכשיר μSiM במשך 2, 4 או 6 ימים ובמסנני transwell במשך 6 ימים. הבדיקה בוצעה באמצעות 150 מיקרוגרם / מ”ל לוציפר צהוב (457 Da) בשתי המעבדות. שונות גבוהה בחדירות תאי האנדותל שגודלו בתרבית במשך יומיים במכשיר מצביעה על כך שיומיים של תרבית לא הספיקו להבשלת המחסום. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בחדירות בין המעבדות עם הבשלת המחסום – מ-4 ימים ואילך. הראינו גם כי החדירות של תאי אנדותל שגודלו בתרבית במסנני μSiM וטרנסוול במשך 6 ימים תאמה את אלה שפורסמו קודם לכן40. איור 1: שלבים של הרכבת μSiM . (A) הכינו את השבב על ידי הנחתו על מתקן A1. מקם את תעלת השבב למעלה להתקן תעלות סופי. הניחו את תעלת השבב למטה להתקן תעלה סופי. (B) הצמידו את רכיב 1 לשבב על-ידי הסרת מסכות המגן מרכיב 1 והצבתן עם הפנים כלפי מטה לתוך FA1. קשר על ידי הפעלת לחץ עם מתקן A2. (ג) קשר רכיב 2 ורכיב 1 על ידי הסרת רכיב 2 מהיריעה וקילוף שכבות ההגנה העליונות. מקם את התעלה במתקן B1 והנח את רכיב 1 על גבי רכיב 2 כשפניו כלפי מעלה. קשר על ידי הפעלת לחץ עם מתקן B2. קיצורים: FAn = fixture An; FBn = מתקן Bn. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: סכמטיות של תרבות משותפת ותמונות ניגודיות פאזה מייצגת של תרביות תאים בהתקנים. (A) מיקום של זריעת תאי פריציטים ואנדותל. (B) סכמה צדדית של מיקומי תאים על פני התעלה של שבב הממברנה. (C) תמונות מייצגות של צפיפות זריעה נמוכה ואופטימלית עבור HBVP ראשוני וקו תאי אנדותל מוח hCMEC/D3. התמונות נרכשו יום אחד לאחר הזריעה (HBVP) ושעתיים לאחר הזריעה (hCMEC/D3). (D) תמונות מייצגות של צפיפויות זריעה נמוכות, גבוהות ואופטימליות עבור תאים דמויי פריציטים במוח שמקורם ב-hiPSC. התמונות נרכשו יום אחד לאחר הזריעה. (E) תמונות מייצגות של התרבות המשותפת הסופית HBVP ו-hCMEC/D3 ומונוקולטורה של hCMEC/D3. התמונות נרכשו 8 ימים לאחר זריעת HBVP ו-7 ימים לאחר זריעת hCMEC/D3. (F) תמונות מייצגות של תרבית תאים כושלת ומוצלחת דמוית BPLC ו-EECM-BMEC ומונוקולטורה של תאים דמויי EECM-BMEC. התמונות נרכשו 7 ימים לאחר זריעת BPLC ו-6 ימים לאחר זריעת EECM-BMAC. תרבויות BPLC חסרות זרע אינן מצליחות לקבל כיסוי מספיק, בעוד שתרבויות BPLC מפקחות יגדלו בזרם יתר ויתחילו להתגבש/לסגת. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (C-F). קיצורים: HBVPs = פריציטים וסקולריים במוח האדם; hiPSC = תא גזע פלוריפוטנטי המושרה על ידי אדם; BPLCs = תאים דמויי פריציטים במוח שמקורם ב-hiPSC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: תמונות מייצגות של תרבית תאי hiPSC המוכתמים במערכת החיסון בהתקנים. התאים הוכתמו עבור סמן תאי אנדותל VE-cadherin (ירוק), סמן pericyte PDGFRβ (אדום), וכתם גרעיני (כחול). ניתן לראות שתי שכבות של תאים בסמיכות, המופרדות רק על ידי ננוממברנה דקה של סיליקון-ניטריד (חץ לבן מסמן את מיקום הממברנה בתמונה השמאלית). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: hiPSC = תא גזע פלוריפוטנטי המושרה על ידי אדם; PDGFRβ = בטא קולטן גורם גדילה הנגזר מטסיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: בדיקת חדירות מולקולות קטנות המבוססת על דגימה. (A) סכמטי של זרימת העבודה הניסויית. (B) הדגמה של יכולת השחזור הבין-מעבדתית בין שתי מעבדות מרוחקות פיזית באוניברסיטת ברן (UniBe), שוויץ, ובאוניברסיטת רוצ’סטר (UR), ניו יורק, ארה”ב: תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC גודלו בתרבית במכשיר μSiM במשך 2, 4 או 6 ימים ובמסנני transwell במשך 6 ימים. בדיקת החדירות בוצעה באמצעות 150 מיקרוגרם / מ”ל לוציפר צהוב (457 Da). הסרגל האדום מציין את נתוני החדירות של נתרן פלואורסצאין (376 Da) שפורסמו בעבר של אותם תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC שגודלו בתרבית במשך 6 ימים במסנני טרנסוול40. N = 4-16 לקבוצה. נעשה שימוש ב-ANOVA דו-כיווני עם מבחן פוסט-הוק של Tukey, והשוואות הוצגו רק עבור p < 0.05 רלוונטי. (C) הדגמה של תגובת ציטוקינים באמצעות תאים דמויי EECM-BMEC שמקורם ב-hiPSC בתרבית ב-μSiM במשך יומיים; 0.1 ננוגרם/מ”ל TNFα + 2 IU/מ”ל IFNγ) או בקרת מדיה (לא מגורה, NS) נוספה לתא העליון למשך 20 שעות לפני בדיקת החדירות באמצעות 150 מיקרוגרם/מ”ל לוציפר צהוב. N = 3 לכל קבוצה. מבחן T לתלמיד, עמ’ < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. שטח פנים זריעה של תא עליון נפח באר עליון שטח פנים של זריעה בתא התחתון עוצמת ערוץ תחתונה ~37 מ”מ2 100 μL (יכול להכיל ≥115 μL) ~42 מ”מ2 10 μL (פיפט 20 μL למניעת בועות) טבלה 1: שטח פנים ונפחים קריטיים של μSiM. יעד קיבוע פתרון חסימה דילול VE-cadherin 4% PFA או 100% MeOH 5% GS + 0.4% Tx-100 או 10% GS + 0.3% Triton X-100 1:50 CD31 4% PFA או 100% MeOH 5% GS + 0.3-0.4% טריטון X-100 1:100 קלודין-5 100% MeOH 5-10% GS + 0.3% טריטון X-100 1:200 ZO-1 100% MeOH 5-10% GS + 0.3% טריטון X-100 1:200 אוקלודין 100% MeOH 5-10% GS + 0.3% טריטון X-100 1:50 PDGFRβ 4% PFA 5% GS + 0.4% טריטון X-100 1:100 NG2 4% PFA 5% GS + 0.4% טריטון X-100 1:100 עז α-עכבר IgG Alexa Fluor 488 1:200 עז α עכבר IgG Alexa Fluor 568 1:200 טבלה 2: נוגדנים ושיטות צביעה שאומתו עבור אימונוציטוכימיה של תרבית משותפת במכשירי μSiM. קיצורים: PFA = paraformaldehyde; MeOH = מתנול; GS = סרום עיזים. קובץ משלים 1: תבנית לחישוב ערך חדירות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

בעוד שבבי הממברנה תוכננו ליציבות, הם יכולים להיסדק או להישבר אם מטפלים בהם בצורה לא נכונה במהלך ההרכבה. לכן, קריטי לאחוז את השבב בחריצי פינצטה השבב ולמקם אותו בעדינות בגוף התאורה. בעת טיפול במכשירים באופן כללי, יש לנקוט משנה זהירות שלא להקפיץ או להפיל את המכשירים. במהלך החיבור של שבב הממברנה למתקן A1, השבב חייב להיות מונח שטוח וממורכז על עמוד המתקן A1 כדי למנוע סדקים בקרום במהלך החיבור לרכיב 1. יתר על כן, יש להימנע מכל מגע עם שכבות ה- PSA החשופות לאחר הסרת מסכות המגן. בעת הטיפול ברכיב 2 לאחר הסרת מסכות המגן, רצוי להחזיק אותו לאורך קצה הרכיב ולהשתמש בפינצטה כדי לתפוס את פינת המשולש שהיא נטולת PSA.

בעוד פרוטוקולים של תרביות תאים תוארו עבור מודלים אפשריים של BBB, מודל התרבית המשותפת BMEC/pericyte של BBB המתואר כאן עשוי להיות מספיק או לא מספיק בהתאם להקשר הפיזיולוגי ולשאלות המעניינות. לדוגמה, סחר בתאי מערכת החיסון מתרחש בעיקר בוורידים הפוסט-נימיים של המוח41,42. באזורים אלה, מרחב פריווסקולרי מפריד בין מחסום BMEC/פריציטים לבין גבולות הגליה שנוצרו על ידי אסטרוציטים. לפיכך, בוורידים פוסט-נימיים, היחידה הנוירו-וסקולרית (NVU) מורכבת משני מחסומים מופרדים פיזית בסדרה, וכפות רגליים אסטרוציטיות אינן נוגעות ישירות במחסום הדם BMEC/פריציטים, המיוצג היטב על ידי המודל הנוכחי. אם המטרה היא מודל NVU שלוקח בחשבון את ההשפעה של גורמים המופרשים על ידי אסטרוציטים על מחסום הדם, ניתן להוסיף תא אסטרוציטים למכשיר המאפשר חילופי גורמים מסיסים דרך החלל הפריווסקולרי. דוגמה זו הודגמה בעבר34 וניתן להרחיב אותה כך שתכלול תאים אחרים כגון מיקרוגליה ונוירונים בתא “מוח” תלת-ממדי. הארכיטקטורה המודולרית של הפלטפורמה מאפשרת להשתמש באסטרטגיות הרכבה פשוטות כדי להשיג תצורות מחדש אלה, כך שהפלטפורמה תהיה פשוטה או מורכבת ככל שיידרש כדי לענות על ההשערות העומדות על הפרק. כל מערך תרבית תאים; עם זאת, חייב להיות מותאם עבור קווי תאים חדשים ותרבויות מרובות. לדוגמה, בשל התכונות של ממברנות סיליקון-ניטריד, ייתכן שיהיה צורך להתאים את פתרונות הציפוי בהשוואה ללוחות תרבית רקמות. הכללת פיברונקטין מסייעת בדרך כלל בהתקשרות תאים ובהישרדותם. יתר על כן, משתמשים יכלו לגדל תאי אנדותל ופריציטים בכיוונים מנוגדים. במקרה זה, ייתכן שיהיה צורך לשנות, למשל, את האופן שבו מדידות החדירות נעשות ומפורשות. עם זאת, מתן צעדים לסוג זה של תרבות הוא מעבר להיקף של מאמר זה.

אתגר נוסף שניתן להיתקל בו במהלך תרבית תאים הוא אידוי מהיר של מדיה, שכן המכשירים יכולים להיות רגישים יותר לשינויים בסביבה בהשוואה לצלחות וצלוחיות סטנדרטיות של תרביות רקמה. אם רואים אידוי עודף או מאטים את גדילת התא, יש למדוד את כל הפרמטרים הקריטיים של האינקובטור כדי להבטיח הגדרות מדויקות. ניתן להוסיף יותר מים לפקק הרקמה או לצלוחית פטרי קטנה הממוקמת בתוך תא תרבית התא, או להחליף מדיה בתדירות גבוהה יותר. יתר על כן, בועות יכולות להיכנס לערוץ התחתון ולהיתקע בתעלה עבור מכשירי תעלות. אמנם ניתן להסיר אותם, אך הכי קל להימנע מהוספת בועות מלכתחילה. כדי לעשות זאת, חשוב לבדוק כי אין בועות בקצה פיפטה או אוויר בקצה פיפטה קצה פיפטה לפני pipeting מדיה לתוך החדר התחתון. יתר על כן, אידוי מדיה בערוץ יכול להוביל לפער בין משטח המדיה לבין ראש הנמל. נפח קטן של מדיה יכול להיות מפוצץ לתוך יציאה אחת עד שהמדיה מגיעה לפני השטח של היציאה הנגדית, ולאחר מכן ניתן להחליף את המדיה באותה יציאה נגדית. בעוד hECSR ו E6 + 10% FBS מדיה לא צריך להיות מחומם באמבט המים, מדיה אחרת ניתן לחמם מראש כדי להפחית היווצרות בועות. אם בועה אכן נכנסת לתא התחתון, ניתן להסיר אותה על ידי הזרמה מהירה של 100 μL דרך התעלה. עם זאת, שיטה זו עלולה להוביל לזיהום בין תאים או מדיה שנשפכים על פני השטח של המכשיר. זה עלול גם לשבש את שכבות התא. לחלופין, ניתן להסיר תחילה את המדיה מהערוץ ולאחר מכן להציג אותה מחדש בנפח של 50 μL. עם זאת, הסרת המדיה תחילה עלולה לגרום להיווצרות בועות נוספות בערוץ. אם בועה אינה נמצאת ישירות מתחת לאזור הממברנה, ניתן להשאיר אותה בתעלה ללא השפעה על תרבית תאים.

התקשרות וגדילה של פריציט, כפי שמודגם באיור 2, יכולות להיות מאתגרות. שימוש בצפיפות זריעה אופטימלית חיוני ליצירת שכבה עם יחס מתאים פיזיולוגית בין תאי פריציט לאנדותל. יתר על כן, כמו pericytes רגישים גזירה, כל חילופי התקשורת בערוץ צריך להיעשות לאט מאוד כדי להגן על התאים. עבור תרבית BPLC, חיבור משופר יכול להיות מושג על ידי ציפוי התא התחתון עם 800 מיקרוגרם / מ”ל קולגן סוג IV או 100 מיקרוגרם / מ”ל פיברונקטין .

אימונוציטוכימיה במכשירים המתוארים כאן מאפשרת ניתוח איכותני של בריאות התא ותפקודו. שיטות להכתמה בצלחות תרבית רקמה או פלטפורמות אחרות צריכות להיות ניתנות לתרגום ישיר לפלטפורמה. עבור תרבית תאים רק בתא העליון, לאחר קיבוע, PBS ניתן להוסיף לתוך החדר התחתון ולהשאיר לשלבים הנותרים, עם חסימה וצביעה נעשה בתא העליון בלבד. זה ממזער את הסיכונים של שבירת הממברנות או מקבל בועות לתוך החדר התחתון. לצביעת תרבית משותפת, אנו ממליצים להשתמש בשני התאים בכל השלבים. חשוב לציין כי צמיגות הקיבוע וה- PBS שונה מזו של המדיה. לכן, זה יכול להיות קל יותר להוסיף בועות לתוך החדר התחתון, ויש לנקוט משנה זהירות כדי לבדוק את קצות פיפטה עבור אוויר בקצה הקצה לפני pipeting לתוך החדר התחתון.

הפרוטוקול המתואר עבור בדיקת חדירות המולקולות הקטנות מאפשר הערכה פונקציונלית וכמותית של תפקוד המחסום של תאי האנדותל בתרבית במכשיר μSiM. בעיה אחת שעשויה להיתקל במהלך בדיקה זו היא משיכת בועות אוויר לתוך פיפטה במהלך איסוף הדגימה מהערוץ התחתון בשלב פרוטוקול 4.1.7.4. כדי להימנע מבעיה זו, חשוב לוודא שהקצה אטום ליציאה לפני תחילת איסוף הדגימה ואין לשאוב את הדגימה מהר מדי. אם פעולה זו אינה פותרת את הבעיה, גודל הקצוות שבהם נעשה שימוש עשוי להיות קטן מדי או גדול מדי מכדי להתאים ליציאות; השתמש בעצות המפורטות בטבלת החומרים. אם ערכי חדירות גבוהים באופן בלתי צפוי נמדדים למרות חד-שכבה קונפלואנטית בריאה למראה, יש לבדוק את שלמות החד-שכבה לאיתור הפרעה במהלך איסוף הדגימה. אנו ממליצים תמיד לבדוק את החד-שכבה מתחת למיקרוסקופ מיד לאחר איסוף הדגימה. אם השכבה החד-שכבתית עדיין נראית שלמה ובריאה, ניתן לתקן את הדגימה ולהעריך סמנים ביולוגיים של תפקוד המחסום, למשל, באמצעות אימונוסטיין של חלבוני הצומת. לעומת זאת, אם נמדדים ערכי חדירות נמוכים באופן בלתי צפוי, חשוב לוודא כי 50 μL של מדיה נדגמים מהערוץ התחתון ללא בועות אוויר. אם התווך יוצא מפתח הדגימה מיד עם מיקום קצה המאגר, יש לאסוף מדיה זו לפני התאמת הפיפטה לפתח הדגימה מכיוון שרוב המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית תהיה נוכחת בנפח הראשוני של 10 μL שנדגם מהתעלה התחתונה. ציור עיגולים סביב היציאות באמצעות עט הידרופובי או הנחת סרט הידרופובי עם חור סביב היציאה מונע התפשטות של מדיה שאובה פסיבית. אם הבועות נמשכות במהלך הדגימה או אם הדגימה המלאה של 50 μL אינה מוסרת, אין להשתמש בדגימה. לחלופין, ניתן לקבוע את הנפח המדויק ולהשתמש בו בחישוב החדירות; עם זאת, זה צריך להיעשות רק אם נפח הוסר הוא ≥40 μL, אשר מתאים ~ 98-99% התאוששות צבע34.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. ו-L.W. מומנו על ידי מענק R33 HL154249 של ה-NIH. J.L.M. מומן על ידי R44 GM137651. M.M. מומן על ידי פרס תוכנית שמידט מכון דל מונטה למדעי המוח, אוניברסיטת רוצ’סטר. M.T. מומן על ידי RF1 AG079138. K.C. מומן על ידי הקרן הבינלאומית למחקר אתי.

Materials

Antibodies
CD31 Polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific PA5-32321
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 Thermo Fisher Scientific 35-2500
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11011
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 Millipore  MAB2029
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 Thermo Fisher Scientific 33-1500
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 Cell Signaling Technology 3169
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 R&D Systems MAB9381
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal Thermo Fisher Scientific 40-2200
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
100% Methanol VWR 101443-718 Can be substituted with similar products
16% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Can be substituted with similar products
Accutase Thermo Fisher Scientific A1110501
Acetic acid Sigma-Aldrich 695092
B27 supplement Thermo Fischer Scientific 17504044
bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen IV from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL Can be substituted with similar products
DMEM/Ham’s F12 Thermo Fisher Scientific 11320033
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Essential 6 medium Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal bovine serum (FBS) Peak Serum PS-FB1
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Fibronectin human protein, plasma ThermoFisher Scientific 33016015 Can be substituted with similar products
hESFM Thermo Fisher Scientific 11111044
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich 861502
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 500627 Can be substituted with similar products
PBS without calcium, magnesium Cytiva SH30256.01 Can be substituted with similar products
Pericyte Medium ScienCell 1201 Use complete kit (includes supplements)
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL ScienCell 0413
Triton X-100 JT Baker X198-05 Can be substituted with similar products
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen™ 10977015 Can be substituted with similar products
Experimental models: Cell lines
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line Sigma-Aldrich SCC066
Human brain vascular pericytes ScienCell 1200
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells WiCell RRID:CVCL_C437
Glassware and Plasticware
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid Falcon 353025
Clamps VWR MFLX06832-10
Corning tissue culture plates (6-well) Corning 3506
Flat 96-well non-binding microplates Greiner Bio-One 655900
Microscope Slide Device Holder  SiMPore USIM-SB Dimensions compatible with micropscope slide holders
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339653 Tube caps can be filled with water for cell culture
P20-200 pipette tips VWR 76322-516 Alternate brands may not seal as effectively into ports
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) CoStar 3401
Instruments
10X Objective (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD00105 Air; WD: 4 mm; NA 0.45
10X Objective (For Nikon) Nikon Instruments Inc. MRP40102 Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25
40X Objective (LWD) (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD77410 Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15
Andor Spinning Disc Confocal microscope Oxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope Nikon Instruments Inc. Can be substituted with similar products
TECAN Infinite M200 TECAN Can be substituted with similar products
Andere
Advanced PAP Pen Millipore Sigma Z672548 2 mm tip is recommended
Assembly kit with fixtures SiMPore USIM-JIGSET Including fixure A1, A2, B1, and B2
Camera Adapter for Microscopes AmScope CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR Φ23.2 – Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera Canon EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 Can be substituted with similar products
Cell strainer, 40 µm Millipore Sigma (Corning) CLS431750
Component 1 SiMPore USIM-C1
Component 2 SiMPore USIM-C2
Membrane chips SiMPore NPSN100-1L Other chips formats are available
SMD handling tweezer double angle Techni-Tool 758TW003 "Chip Tweezers"
Stainless steel precision type GG tweezer Techni-Tool 758TW534 "Straight Tweezers"
Software
Fiji ImageJ For image processing
Fusion Oxford Instruments, Andor Instructions for version 2.3.0.44
i-control TECAN Instructions for version 2.0
Imaris Oxford Instruments For image processing. Instructions for version 9.9.0
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405 (2019).
  2. Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
  3. Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson’s disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813 (2011).
  4. Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451 (2022).
  5. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
  6. Ortiz, G. G., et al. Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis. Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).
  7. Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
  8. Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222 (2022).
  9. Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
  10. Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
  11. Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
  12. Abbott, N. J., et al. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).
  13. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  14. Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671 (2016).
  15. van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
  16. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  17. Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770 (2023).
  18. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685 (2021).
  19. Lea, T., et al., Verhoeckx, K., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , (2015).
  20. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  21. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  22. Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
  23. Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880 (2021).
  24. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  25. Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
  26. Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
  27. DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
  28. Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750 (2020).
  29. Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111 (2019).
  30. Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
  31. Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
  32. Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
  33. Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
  34. McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804 (2022).
  35. Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802 (2022).
  36. Su, S. -. H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030 (2023).
  37. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
  38. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  39. Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21 (2021).
  40. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  41. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  42. Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. What is the blood-brain barrier (not). Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).

Tags

Blood-brain BarrierMicroSiMμSiMInduced Pluripotent Stem CellsSepsisInflammationBlood-borne FactorsGenetic FactorsReproducibilityFunctional AssaysHigh-resolution Live ImagingPermeability AssaysExtracellular MatrixAstrocytesMicrogliaPostoperative DeliriumDementia

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
McCloskey, M. C., Kasap, P., Trempel, M., Widom, L. P., Kuebel, J., Chen, K., Gaborski, T. R., Engelhardt, B., McGrath, J. L. Use of the MicroSiM (µSiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (203), e65258, doi:10.3791/65258 (2024).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image