血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

1. μSiMデバイスの組み立て メモ: この方法では、デバイスの組み立てについて説明します。メンブレンチップにはトレンチ側とフラットサイドがあり、トレンチアップまたはトレンチダウンで組み立てることができます。トレンチダウン装置は、細胞培養に最も一般的に使用されます。 無菌環境(バイオセーフティフードなど)で、組み立て治具、コンポーネント、メンブレンチップ、ピンセットなど、組み立て用のすべての材料を準備します。 チップピンセットを使用して、メンブレンチップをフィクスチャーA1の中心に配置します。チップの平坦な面は下向きで、トレンチ領域はトレンチダウンデバイスの場合は上を向き、トレンチアップデバイスの場合は その逆です 。注:以下の組み立て手順は、トレンチダウン装置を例にとって説明されており、これにより、上部チャンバー内の成長領域が平坦になります。 コンポーネント 1 をチップに接着します。まず、まっすぐなピンセットを使用してコンポーネント1の両側にある青い保護層をはがし、上部チャンバーを下にして固定具A1に配置します。粘着剤(PSA)がチップに触れるまで、コンポーネント1をゆっくりと押し下げます。 治具A2を固定具A1に置き、さまざまなコーナーにしっかりと圧力をかけて、チップとコンポーネントがしっかりとフィットするようにします。メモ:PSA層を外さないでください。これは、青い保護層に比べて透明で硬い層です。 部品2を部品1にチップで接着します。まず、部品2の片隅をまっすぐピンセットで掴み、シートから剥がして部品2を準備します。次に、コンポーネント2の非PSAの「三角形」領域をつかみ、コンポーネント2の厚くて透明な保護層と青色の層を一緒に取り外して、PSA表面を露出させます。コンポーネント 2 を PSA 側を上にして器具 B1 に置きます。 メンブレンチップをフィクスチャーB1に置き、上部チャンバーを上に向けてコンポーネント1を配置します。 フィクスチャ B2 をコンポーネント 1 に置き、フィクスチャ B2 のさまざまな角にしっかりと圧力をかけます。 組み立てたデバイスを固定具から取り出し、まっすぐなピンセットを使用してデバイスの下側の気泡を押し出し、チャネルx’の端を密閉し、膜領域との接触を避けます。細胞培養に使用する前に、新しく組み立てたデバイスを20分間紫外線(UV)滅菌します。 2. 細胞培養 注:この方法では、プラットフォーム上の初代培養およびiPS細胞由来培養のプロトコルについて説明します。この方法は、デバイスのトップチャンバーでの内皮細胞の単培養と、トレンチダウン組み立てデバイスの下部チャンバーでのペリサイトおよび内皮細胞とのペリサイトおよび内皮細胞の共培養について説明しています。チャンバーの寸法と容量については、 表1を参照してください。これらは最も一般的な形式です。ただし、ユーザーのニーズに応じて、他の細胞培養レイアウトを使用できます。 細胞培養チャンバーの準備セクション 1 で詳述されているプロトコルに従ってデバイスを組み立てます。 デバイスを滅菌ホースクランプに入れます。細胞培養の前に、クランプをエタノールに≥20分間浸して滅菌します。各実験後に再滅菌して再利用します。 大きな滅菌ペトリ皿でデバイスを培養します。湿度を高めるには、滅菌水で満たされた小さなペトリ皿または50 mLの円錐形チューブ蓋を追加します。 デバイスの上部チャンバーを100μLの滅菌水で2回洗浄します。ボトムチャンバーでの細胞培養の場合は、ボトムチャンバーを20 μLの滅菌水で洗浄します。 hCMEC/D3細胞株(BBB)単培養セクション2.1に従って細胞培養チャンバーを準備します。 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に混合した25 μg/cm 2のコラーゲンIと5 μg/cm2のヒトフィブロネクチンで上部チャンバーをコーティングします。37°Cで1〜2時間、または4°Cで一晩放置します。 コーティング液を除去し、予熱した成長因子枯渇内皮培地(アッセイ培地)100 μLを上部チャンバーに、20 μLを下部チャンバーに加えます。アッセイ培地を調製するには、100 mLの内皮基礎培地+400 μLのヒト線維芽細胞増殖因子+40 μLのヒドロコルチゾン+100 μLの硫酸ゲンタマイシン+2 mLのウシ胎児血清を混合します。 メーカーのプロトコルに従ってhCMEC / D3細胞を継代します。37°Cのインキュベーターで3〜5分間細胞をトリプシン化した後、予熱した内皮培地を添加してトリプシン化を停止します。細胞懸濁液を遠心チューブに移し、室温で200×gで5分間遠心分離します。細胞ペレットをアッセイ培地に再懸濁し、40,000〜60,000細胞/cm2の密度で上部チャンバーに細胞を播種します。デバイスを37°Cで5%二酸化炭素(CO 2)と2〜4時間インキュベートして、細胞接着を促進します。例えば、0.37 cm 2 チップで 40,000 cells/cm2 を達成するには、150,000 cells/mL の濃度の細胞溶液 100 μL をトップチャンバーに添加します。注:細胞維持のために内皮増殖培地-2(EGM-2)の改変製剤を使用し、アッセイのために継代培養後に成長因子を減少させた「アッセイ培地」を使用して、Hudecz et al.38に従ってhCMEC/D3を培養および継代しました。他の培地製剤はデバイスと互換性があるはずですが、ユーザーがhCMEC/D3の生存に問題を経験する場合は、Hudecz et al.38 の培地製剤を推奨します。 細胞接着のために2〜4時間後、両方のチャンバーで新しいアッセイ培地と交換して、死んだ細胞または付着していない細胞を除去します。 デバイスを5%CO2で37°Cに維持し、実験まで2〜3日ごとに両方のチャンバーでアッセイ培地を交換します。アッセイは通常、2週間の培養後に実施されます。 iPS細胞由来EECM-BMEC様細胞単細胞培養セクション2.1に従って細胞培養チャンバーを準備します。 ヒト胎盤溶液から、5 mgのコラーゲンIVに0.5 mg/mLの酢酸5 mLを加えて1 mg/mLの溶液を調製します。溶液を4°Cで≥4時間放置して、完全に再溶解させます。溶液は4°Cで2週間安定です。 上部チャンバーを 100 μL の 4:1:5 の比率のコラーゲン IV、ウシフィブロネクチン、および滅菌水でコーティングします。37°Cで2〜4時間コーティングします。 コーティング液を除去し、室温hECSR100μLを上チャンバーに、20μLを下チャンバーに加えます。 Nishihara et al.37によるEECM-BMEC様細胞の継代;細胞剥離酵素混合物を細胞に加え、37°Cのインキュベーターに5〜8分間移します。細胞溶液をピペットでつなぎ、単数化し、遠心チューブ内の内皮培地の体積を4倍に添加します。室温で200×gで5分間遠心分離する。細胞をhECSRに再懸濁し、40,000細胞/cm2の密度で上部チャンバーに播種します。デバイスを37°Cで5%CO2で2〜4時間インキュベートし、細胞の接着を促進します。例えば、40,000細胞/cm2を達成するには、150,000細胞/mLで100μLの細胞溶液を添加します。 細胞接着のために2〜4時間後、両方のチャンバーで新しいhECSRと交換して、死んだ細胞または付着していない細胞を除去します。 デバイスを5%CO2で37°Cに維持し、実験まで1〜2日ごとに両方のチャンバーでhECSRを交換します。アッセイは通常、培養の6日目に実施されます。 hCMEC/D3と初代ヒト脳血管周皮細胞(HBVP)の共培養デバイスを組み立てる前に、PBSに混合した2 μg/cm2 のポリ-L-リジン(PLL)でメンブレンチップをコーティングします。50〜80μLのPLLを液滴に含め、最終的なデバイスアセンブリで下向きになる側にのみ塗布します。コーティングプロセスは、37°Cで1〜2時間、または4°Cで一晩完了します。 塗工液を取り除きます。メンブレンチップを滅菌超純水で洗浄し、乾燥させます。 上記のセクション1で詳述したプロトコルに従って、PLLコーティングされた面を下に向けてデバイスを組み立て、セクション2.1に従って細胞培養チャンバーを準備します。 セクション2.2.2に従ってトップチャンバーをコーティングします。 50 μLの予熱した周皮細胞培地を上部チャンバーに追加し、20 μLを下部チャネルに添加します。 メーカーのプロトコルに従ってHBVPを通過させます。37°Cのインキュベーターで細胞を3〜5分間トリプシン化した後、予熱した周皮細胞培地を添加してトリプシン化を停止します。細胞懸濁液を遠心チューブに移し、室温で200 × g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを周皮細胞培地に再懸濁し、14,000〜25,000細胞/cm2の密度で細胞を底室に播種します。デバイスを反転させますが、ガス交換を容易にするために上部チャンバーとの空気インターフェースを維持します。注意: 反転中に必要なエアインターフェースは、デバイスをホースクランプ内に配置した後、反転させ、反転する前にすべての角を押し下げるか、上部チャンバーを遮らないように十分な間隔を空けてアクリルまたはシリコンの平行ストリップにデバイスを逆さまに置くことで実現できます。シード密度は、ユーザーごとに最適化する必要がある場合があります。14,000 cells/cm2 を達成するには、~590,000 cells/mL で 20 μL の細胞懸濁液を添加します。気泡を避けるために20 μLを底部チャンバーにピペットで注入しますが、密度は底部チャンバー容量10 μLを使用して計算されます。 細胞を37°Cで5%CO 2と逆さにした状態で2 〜4時間インキュベートし、細胞の接着を促進します。 細胞接着のために2〜4時間後、デバイスを直立させ、両方のチャンバーで新鮮な周皮細胞培地と交換して、死んだ細胞または付着していない細胞を除去します。 周皮細胞播種後、ステップ2.2.4-2.2.5に従って、hCMEC/D3を上部チャンバーに播種します。両方のチャンバーをアッセイ培地に切り替えます。 デバイスを5%CO2で37°Cに維持し、実験まで1〜2日ごとに両方のチャンバーでアッセイ培地を交換します。初代細胞の共培養は、通常、アッセイの6〜8日前に維持されます。注:HBVP単培養をhCMEC / D3単培養またはhCMEC / D3およびHBVP共培養と比較する場合は、HBVPを播種してから2〜3日後に周皮細胞培地をアッセイ培地と交換します。 iPS細胞由来EECM-BMEC様細胞と脳周皮細胞様細胞(BPLC)の共培養セクション2.1に従って細胞培養チャンバーを準備し、ステップ2.3.2-2.3.3に従ってトップチャンバーをコーティングします。 コーティング液を除去し、室温で50 μLのEssential 6 Medium + 10% Fetal Men Serum (E6 + 10% FBS)をトップチャンバーに加えます。 Gastfriend et al.39によるBPLCの通過。細胞に細胞剥離酵素混合物を加え、細胞の~90%が丸くなるまで37°Cのインキュベーターに5〜15分間移します。細胞溶液をピペットで単数化し、40 μmのセルストレーナーを使用して50 mLの遠心分離チューブに4倍の量のDMEM/F12を加え、細胞をろ過して完全に単数化します。15mLの遠心チューブに移し、室温で200× g で5分間遠心分離し、細胞ペレットをE6 + 10Sに再懸濁し、14,000〜25,000細胞/cm2の密度で底室に細胞を播種する。装置を反転させますが、ガス交換を容易にするために、上部チャンバーとの空気インターフェースを維持します。注意: 反転中に必要なエアインターフェースは、ホースクランプ内にデバイスを配置した後、デバイスをひっくり返し、反転する前にすべての角を押し下げるか、上部チャンバーが遮られないように十分な間隔を空けて、アクリルまたはシリコンの平行ストリップにデバイスを逆さまに置くことで実現できます。シード密度は、ユーザーごとに最適化する必要がある場合があります。14,000 cells/cm2 を達成するには、~590,000 cells/mL で 20 μL の細胞懸濁液を添加します。気泡を避けるために20 μLを底部チャンバーにピペットで注入しますが、密度は底部チャンバー容量10 μLを使用して計算されます。 細胞を37°Cで5%CO 2と逆さにした状態で2 〜4時間インキュベートし、細胞の接着を促進します。 細胞接着のために2〜4時間後、デバイスを直立させ、両方のチャンバーで新しいE6 + 10Sと交換して、死んだ細胞または付着していない細胞を除去します。 周皮細胞播種の1日後、ステップ2.3.5-2.3.6に従って、EECM-BMEC様細胞を上部チャンバーに播種します。両方のチャンバーをhECSRに切り替えます。 デバイスを5%CO2で37°Cに維持し、実験まで1〜2日ごとに両方のチャンバーでアッセイ培地を交換します。ヒトiPS細胞由来の共培養は、通常、BPLCでは7日間、EECM-BMEC様細胞では6日間維持されます。注:BPLC単培養をEECM-BMEC単培養またはEECM-BMECおよびBPLC共培養と比較する場合は、BPLCを播種してから1日後にE6 + 10SをhECSRと交換します。 3. 免疫細胞化学 注:この方法は、膜の上面および/または下面で培養した細胞の免疫細胞化学的染色およびイメージングのためのプロトコルを説明しています。この実験の目的は、アドヘレンやタイトジャンクションタンパク質、細胞同一性タンパク質など、BBBに存在するはずの重要なタンパク質の存在と位置を決定することです。代替染色法と生染色法もプラットホームと互換性があります。 デバイスの固定と染色一次抗体を氷上に置いて解凍します。 室温で4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製するか(例:16%PFAをPBSの3倍の容量で希釈)、100%メタノールを-20°Cで冷却します。 表 2 に従って適切なブロッキング溶液を作成します。氷の上に保管してください。注意:Triton X-100を完全に溶解するには、溶液のボルテックスが必要な場合があります。 20 μLの固定液(PFAやメタノールなど)を下部チャンバーに、50 μLを上部チャンバーにピペッティングして細胞を固定します。デバイスを室温で10分間(PFA)または2分間(メタノール)インキュベートします。 20 μL の PBS をボトムチャンバーに、100 μL をトップチャンバーにピペッティングして、5 分間 x 3 分間洗浄します。 底チャンバーにブロッキング溶液20 μLを、上部チャンバーにブロッキング溶液50 μLを加えて、室温で30分間ブロッキングします。底部チャンバーに気泡がないか確認してください。 表2に従って、抗体をブロッキング溶液で希釈して一次抗体溶液を調製します。氷の上に保管してください。 一次抗体溶液20 μLをボトムチャンバーに添加し、トップチャンバーの容量を50 μLの一次抗体溶液に置き換えて、一次抗体で染色します。底部チャンバーに気泡がないか確認してください。室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 20 μL の PBS をボトムチャンバーに、100 μL をトップチャンバーにピペッティングして、5 分間 x 3 分間洗浄します。 抗体を表2に従ってブロッキング溶液で希釈して二次抗体溶液を調製する。光から保護された氷の上に保管してください。 20 μLの二次抗体溶液をボトムチャンバーに添加し、トップチャンバーの容量を50 μLの二次抗体溶液に置き換えて、二次抗体で染色します。底部チャンバーに気泡がないか確認してください。光から保護された室温で1時間インキュベートします。 20 μL の PBS をボトムチャンバーに、100 μL をトップチャンバーにピペッティングして、5 分間 x 3 分間洗浄します。 核染色液を作ります。Hoechst 1:10,000 を PBS で希釈します。20 μLの核染色溶液を下部チャンバーに加え、上部チャンバーの容量を50 μLの核染色溶液と交換します。底部チャンバーに気泡がないか確認してください。光から保護された室温で3分間インキュベートします。 底部チャンバーに20 μLのPBSを添加し、上部チャンバーの容量を100 μLのPBSに置き換えて、染色物を除去します。デバイスをすぐに画像化するか、ペトリ皿をパラフィルムで包み、イメージングの準備が整うまで光から保護して4°Cで保管してください。 共焦点イメージング注:このセクションでは、例として、長作動距離(LWD)40倍対物レンズ(水、WD 590-610、開口数1.15)を備えた倒立回転ディスク共焦点顕微鏡を使用したデバイスのイメージングについて説明します。作動距離とレンズの互換性については、McCloskey et al.34 の補足資料を参照してください。膜領域全体の画像も10倍の対物レンズを使用して撮影され、40倍の画像がフィールド全体を表すようにします。これらは通常、広視野で撮影されます。顕微鏡の電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。 二次抗体と核染色の特性に応じて、 共焦点イメージングモードを使用してチャンネルを設定します。レーザー出力と露光時間を最適化して、信号がバックグラウンドより上になるようにし、イメージングアーチファクトを低減します。ヘキスト核染色には、励起405、発光450/50バンドパス(BP)、露光時間500ms、レーザー出力50%を使用します。Alexa Fluor(AF)488に結合した二次抗体を用いた標識には、励起488、発光525/50BP、露光時間500ms、レーザー出力50%を使用します。AF568に結合した二次抗体を用いた標識には、励起561、発光600/50BP、露光時間500ms、レーザー出力100%を使用します。 デバイスを顕微鏡スライドデバイスホルダーに置き、上部チャンバーを上に向けて、顕微鏡スライドホルダーを使用して顕微鏡にセットします。 Live をオンにして、核染色のチャンネルを選択します。光は青色の固体シリコーン領域を透過しないため、透明な窒化ケイ素膜領域が中央にあることを確認して、低い対物レンズを使用して膜を見つけます。デバイスが適切にセンタリングされ、細胞層が見つかったら、40倍対物レンズに切り替え、対物レンズを湿潤させ、核染色をガイドとして使用して膜領域に焦点を合わせます。 z-stackイメージングをオンにし、スキャンモードを開始/終了に設定します。ステップサイズまたはステップ数を設定します。顕微鏡の粗調整ノブを使用して、核染色をガイドとして使用してスキャン開始を内皮細胞層の上部に設定し、核染色をガイドとして使用して周皮細胞層の下部にスキャン終了を設定します。すべてのチャンネルをチェックして、すべてがイメージングフィールドでキャプチャされることを確認します。注:通常、~0.2μmのスライスである自動ステップを使用します。 Image Nameを設定し、 Acquire を押してイメージングを開始します。必要に応じて、異なる領域で繰り返します。 ImageJ40 または Imaris を使用して共焦点画像を処理します。Imarisで処理するには、画像ファイルをプログラムにドラッグして開きます。上部のメニューバーで [断面 ]を選択すると、x-y平面の2D画像と、x-z平面とy-z平面の対応するビューが表示されます。上部のメニューバーで[3Dビュー]を選択して、 3D 画像を表示します。画像をクリックしてドラッグし、回転させます。上部のメニューバーで[ スナップショット ]を選択して、画像を撮影します。 4. 低分子透過性のサンプリングアッセイ 注:このセクションでは、細胞培養のバリア特性を定量的に測定するための方法論について説明します。この実験の目的は、細胞層を通過してプラットフォームの底部チャンバーに入る蛍光小分子の濃度を検出することです。次に、これらのデータを使用して細胞透過性を計算します。 サンプリング技術セクション1で詳述したプロトコルに従ってデバイスを組み立て、セクション2で説明したように目的の細胞株を培養します。システムの透過性を測定するために、無細胞のコーティングされた制御装置として機能する追加のデバイスを含めます。注: 条件ごとに最低 3 つのテクニカル レプリケートが推奨されます。ただし、コートされたコントロールの複製は 1 回のみ必要です。 サンプリングアッセイを開始する前に、底部チャンバーの培地を新しい培地と交換してください。各デバイスの内皮単層のコンフルエント度を顕微鏡で確認します。細胞単層に隙間があると、底部チャンバーへの色素の拡散に影響するため、注意してください。注:健康な内皮培養物は100%コンフルエントでなければなりません。 蛍光低分子溶液(例:150 μg/mL Lucifer Yellow、457 Da)を細胞培養培地で調製します。ボトムチャンネルからサンプリングした蛍光低分子の濃度を計算するための基準となる標準溶液の調製に使用する蛍光低分子溶液を過剰に調製します。注:蛍光低分子の濃度が最も高い標準溶液として使用するために、400 μLの過剰溶液を調製することをお勧めします。 上部ウェルの培地を100 μLの蛍光低分子溶液と交換します。注意: 疎水性ペンを使用してサンプリングポートの周囲に円を描き、疎水性インクが完全に乾くまで待ってから蛍光染料溶液を追加することをお勧めします。これにより、ステップ4.1.7でサンプリングポートの周りの下部チャネルから媒体が広がるのを防ぎます。蛍光低分子溶液を上部にずらして2分間待ってから次のデバイスに追加するか、3つのグループで作業することをお勧めします(溶液を3つのデバイスに同時に追加し、5分間待って次の3つのデバイスを追加する)。 デバイスを37°C、5%CO2 で1時間インキュベートします。 前のステップでの1時間のインキュベーション中に、ステップ4.1.3で調製した蛍光低分子溶液から2倍段階希釈を行い、標準溶液を調製します。各溶液50 μLを平底の黒色96ウェルプレートに3回に分けてピペットで入れます。ブランク細胞培養培地をベースライン標準液として使用します。注:標準溶液を調製するには、最終容量200 μLで11段階希釈し、細胞培養培地をブランクとして使用してベースラインの蛍光強度を測定することをお勧めします。ステップ4.1.3で調製した過剰な蛍光低分子溶液400μLのうち200μLを培地200μLのチューブに移し、よく混合し、この溶液200μLを培地200μLの入った次のチューブに移す。合計10本のチューブになるまで、1:2の希釈を繰り返します。50 μL の最も濃度の高い標準溶液を 96 ウェルプレートのカラム 1 に 3 回に分けてピペットで移し(B1、C1、D1)、2番目に 濃度の高い溶液をカラム 2(B2、C2、D2)にピペットでつなぎます。プレートの12番目の カラムに、50 μLのブランク培地を3回に分けてピペット(B12、C12、D12)します。 以下のステップを実行して、下部チャネルから蛍光低分子溶液をサンプリングします。蛍光性低分子溶液をウェルから取り出して、拡散プロセスを停止します。 培地50 μLのチップをポートに挿入し、デバイスを持ち上げ、上部を押さえながらチップを静かに排出して安定させ、リザーバーとして機能するように上部ポートに配置します。デバイスを置きます。サンプリング中に底部チャンバーに気泡が入らないように、ピペットの先端に気泡やピペットの先端に空気がないことを確認してください。 サンプリング中の細胞単層の破壊を防ぐために、50 μLの培地を上部ウェルに添加します。 ボトムチャンネルから溶液をサンプリングするには、ピペットチップが空のピペッターを最初の抵抗まで押し込み、チップをサンプリングポートに挿入し、ボトムチャンネルから50 μLの溶液を逆ピペッティングします。標準溶液を含む平底の黒色の 96 ウェルプレートに直接移します。注:サンプリング後すぐに顕微鏡で細胞単層を確認することをお勧めします。下部のチャネルから培地を採取すると、上部ウェルの細胞層が破壊され、透過性測定に一貫性がなくなることがあります。4.1.7 の手順で迅速に作業することで、これを防ぐことができます。 使用する蛍光低分子の適切な励起波長および発光波長パラメータを使用して、マイクロプレートリーダーで蛍光強度を測定します。Lucifer Yellowには、428 nmの励起と536 nmの発光を使用し、最適なゲインを実現します。蛍光はプレートの上部から測定されます。プレートをプレートリーダーに追加し、サンプル(検量線を含む)を含むウェルをハイライトし、 開始 を選択してプレートを読み取ります。 透磁率値の計算(テンプレートについては 補足ファイル1 を参照)測定したすべての蛍光強度値から、ブランク培地の平均蛍光強度値を差し引きます。 式 (1) を使用して、システムの透磁率 Ps を計算します。(1)ここで、[A]A は底流路から採取した蛍光低分子の濃度、V はサンプリングしてプレートに添加した容量(0.050 mL)、 [A]L は上部ウェルに添加した蛍光低分子の濃度(例:0.15 mg/mL)、t はインキュベーション時間(所望の単位に応じて s または分)、 Sは膜表面積(0.014 cm2)です。蛍光強度の出力と標準溶液の既知の濃度から検量線をプロットして得られた式を使用して、[A]A を計算します。蛍光強度値(y)を式に挿入して、実験サンプルの濃度(x)を計算します。注:検量線の線形部分を使用してください。膜面積はロット番号によって異なる場合があり、コーティングされたコントロールと異なる場合、計算された透過率値に大きな影響を与える可能性があるため、顕微鏡で撮影した膜の画像から膜表面積を測定することをお勧めします。 式(2)を使用して、セル単層PEの透磁率を計算します。(2)ここで、PSは、ステップ4.2.2で計算されたシステム透磁率であり、PCは、無細胞、コーティングされた制御装置のシステム透磁率の値である。