Abgleich von optischen Kohärenztomographie-Fasergrammen im sichtbaren Licht mit konfokalen Bildern derselben Maus-Netzhaut
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Schritte zum Abgleich von in vivo Bildern der optischen Kohärenztomographie (Vis-OCTF) mit konfokalen ex vivo Bildern derselben Mausnetzhaut, um die beobachtete Morphologie der retinalen Ganglienzell-Axonbündel in den in vivo Bildern zu verifizieren.
Abstract
In den letzten Jahren wurde die In-vivo-Netzhautbildgebung, die nicht-invasive, Echtzeit- und Längsschnittinformationen über biologische Systeme und Prozesse liefert, zunehmend eingesetzt, um eine objektive Beurteilung von neuronalen Schäden bei Augenerkrankungen zu erhalten. Die konfokale Ex-vivo-Bildgebung derselben Netzhaut ist oft notwendig, um die in vivo Befunde zu validieren, insbesondere in Tierversuchen . In dieser Studie haben wir eine Methode demonstriert, mit der ein konfokales ex vivo Bild der Maus-Netzhaut mit ihren in vivo Bildern abgeglichen werden kann. Eine neue klinische Bildgebungstechnologie, die optische Kohärenztomographie (vis-OCTF), wurde eingesetzt, um In-vivo-Bilder der Netzhaut der Maus zu erhalten. Anschließend führten wir die konfokale Bildgebung derselben Netzhaut wie den “Goldstandard” durch, um die in vivo vis-OCTF-Bilder zu validieren. Diese Studie ermöglicht nicht nur die weitere Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, sondern schafft auch die Grundlage für eine sensitive und objektive Bewertung von neuronalen Schäden in vivo.
Introduction
Retinale Ganglienzellen (RGCs) spielen eine entscheidende Rolle bei der visuellen Informationsverarbeitung, indem sie synaptische Inputs über ihre dendritischen Bäume in der inneren plexiformen Schicht (IPL) empfangen und die Informationen über ihre Axone in der retinalen Nervenfaserschicht (RNFL) an das Gehirn weiterleiten 1,2,3,4. Bei Erkrankungen wie dem Glaukom kann eine frühe RGC-Degeneration sowohl bei Patienten als auch bei Nagetiermodellen zu subtilen Veränderungen der RNFL, der Ganglienzellschicht (GCL), des IPL und des Sehnervs führen 5,6,7,8,9. Die frühzeitige Erkennung dieser morphologischen Veränderungen bei RGCs ist daher für eine rechtzeitige Intervention zur Vorbeugung von RGC und Sehverlust unerlässlich.
Wir haben kürzlich eine neue klinische Bildgebungstechnologie namens optische Kohärenztomographie (Vis-OCT) entwickelt, um den Bedarf an In-vivo-Überwachung von RGC-Schäden zu decken. Vis-OCT verbesserte die axiale Auflösung auf 1,3 μm in der Netzhaut10,11 und ermöglichte die Visualisierung einzelner RGC-Axonbündel in der RNFL. In der Folge wurde die Vis-OCT-Fasergraphie (Vis-OCTF) etabliert, um RGC-Schäden auf der Ebene einzelner Axonbündel bei Mäusen zu verfolgen und zu quantifizieren11,12,13. Eine konfokale Ex-vivo-Bildgebung derselben Netzhaut wie der Goldstandard ist jedoch häufig erforderlich, um die In-vivo-Ergebnisse zu validieren. Daher wird diese Studie zeigen, wie in vivo Bilder, die mit vis-OCTF aufgenommen wurden, mit ex vivo konfokalen Bildern derselben Maus-Netzhaut abgeglichen werden können. Das Protokoll zielt darauf ab, die in vivo Befunde durch konfokale Ex-vivo-Bildgebung zu validieren und eine Grundlage für die Untersuchung der molekularen und zellulären Veränderungen zu schaffen, die RGC-Schäden unter kranken Bedingungen zugrunde liegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt zwei Schritte in diesem Protokoll, die Aufmerksamkeit erfordern. Zunächst muss sichergestellt werden, dass sich das Tier unter Tiefennarkose befindet und dass seine Augen vor der Vis-OCT-Bildgebung vollständig geweitet sind. Wenn die Mäuse nicht ausreichend betäubt werden, kann ihre schnelle Atmung zu instabilen Bewegungen der Gesichtsbilder führen, was sich negativ auf die Qualität des Fibergramms auswirken kann. Darüber hinaus kann sich eine unzureichende Dilatation auch negativ auf die Bildqual…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wird unterstützt durch den Shaffer Grant der Glaucoma Research Foundation, den 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 und die Knights Templar Eye Foundation.
Materials
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
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