Uitlijning van optische coherentietomografievezelgrammen in zichtbaar licht met confocale beelden van hetzelfde netvlies van de muis
Summary
Het huidige protocol schetst de stappen voor het in vivo uitlijnen van optische coherentietomografie-vezelgrafiebeelden (vis-OCTF) in vivo met ex vivo confocale beelden van hetzelfde netvlies van muizen met het oog op het verifiëren van de waargenomen morfologie van de axonbundel van retinale ganglioncellen in de in vivo beelden.
Abstract
In de afgelopen jaren is in vivo retinale beeldvorming, die niet-invasieve, real-time en longitudinale informatie over biologische systemen en processen biedt, steeds vaker toegepast om een objectieve beoordeling van neurale schade bij oogziekten te verkrijgen. Ex vivo confocale beeldvorming van hetzelfde netvlies is vaak nodig om de in vivo bevindingen te valideren, vooral in dieronderzoek. In deze studie demonstreerden we een methode om een ex vivo confocaal beeld van het netvlies van de muis uit te lijnen met de in vivo beelden. Een nieuwe klinische beeldvormingstechnologie, optische coherentietomografievezelgrafie met zichtbaar licht (vis-OCTF) genaamd, werd toegepast om in vivo beelden van het netvlies van de muis te verkrijgen. Vervolgens voerden we de confocale beeldvorming uit van hetzelfde netvlies als de “gouden standaard” om de in vivo vis-OCTF-beelden te valideren. Deze studie maakt niet alleen verder onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen mogelijk, maar legt ook de basis voor een gevoelige en objectieve evaluatie van neurale schade in vivo.
Introduction
Retinale ganglioncellen (RGC’s) spelen een cruciale rol bij de visuele informatieverwerking, ontvangen synaptische input via hun dendritische bomen in de binnenste plexiforme laag (IPL) en verzenden de informatie via hun axonen in de retinale zenuwvezellaag (RNFL) naar de hersenen 1,2,3,4. Bij zieke aandoeningen zoals glaucoom kan vroege RGC-degeneratie leiden tot subtiele veranderingen in de RNFL, de ganglioncellaag (GCL), de IPL en de oogzenuw bij zowel patiënten als knaagdiermodellen 5,6,7,8,9. Vroege detectie van deze morfologische veranderingen in RGC’s is dus essentieel voor tijdige interventie om RGC en verlies van gezichtsvermogen te voorkomen.
We hebben onlangs een nieuwe klinische beeldvormingstechnologie ontwikkeld, genaamd optische coherentietomografie met zichtbaar licht (vis-OCT) om te voldoen aan de behoefte aan in vivo monitoring van RGC-schade. Vis-OCT verbeterde de axiale resolutie en bereikte 1,3 μm in het netvlies10,11, waardoor de visualisatie van individuele RGC-axonenbundels in de RNFL mogelijk werd. Vervolgens werd vis-OCT-vezelgrafie (vis-OCTF) vastgesteld om RGC-schade op het niveau van de enkele axonbundel bij muizen te volgen en te kwantificeren11,12,13. Ex vivo confocale beeldvorming van hetzelfde netvlies als de gouden standaard is echter vaak nodig om de in vivo bevindingen te valideren. Daarom zal deze studie aantonen hoe in vivo beelden verkregen door vis-OCTF kunnen worden uitgelijnd met ex vivo confocale beelden van hetzelfde netvlies van muizen. Het protocol heeft tot doel de in vivo bevindingen te valideren door middel van ex vivo confocale beeldvorming en een basis te leggen voor het onderzoeken van de moleculaire en cellulaire veranderingen die ten grondslag liggen aan RGC-schade bij zieke aandoeningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee stappen in dit protocol die aandacht behoeven. Ten eerste is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het dier onder diepe anesthesie is en dat hun ogen volledig verwijd zijn voordat ze OCT-beeldvorming zien. Als de muizen niet voldoende worden verdoofd, kan hun snelle ademhaling leiden tot onstabiele bewegingen van de en-face beelden, wat de kwaliteit van het fibergram nadelig kan beïnvloeden. Bovendien kan onvoldoende ontsluiting ook een negatieve invloed hebben op de beeldkwaliteit, aangezien de…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie wordt ondersteund door de Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 en Knights Templar Eye Foundation.
Materials
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
Referenzen
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
- Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
- Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
- Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
- Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
- Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
- Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
- Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
- Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
- Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
- Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
- Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
- Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
- Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
- Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
- Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
- Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).
