Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

Las células ganglionares de la retina (CGR) son las únicas neuronas de proyección en la retina, e integran y transmiten información visual externa al cerebro¹. Muchas enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma y la neuropatía óptica traumática se caracterizan por daño irreversible y pérdida de CGR ^2,3. El análisis de los cambios morfológicos y cuantitativos de las CGR es un paso crucial para determinar cómo se desarrollan y avanzan las enfermedades neurodegenerativas ^4,5.

El ensayo de inmunofluorescencia indirecta es un método ampliamente aceptado para monitorear la distribución de proteínas y el recuento celular. En el laboratorio, la inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza comúnmente en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones fisiológicas y patológicas de la retina⁶. Los marcadores más comunes utilizados para la cuantificación de RGC en toda la retina incluyen Brn3a, proteína de unión a ARN con empalme múltiple (RBPMS), y así sucesivamente ^7,8. La caracterización de la cantidad y distribución de las CGR requiere inmunotinción retiniana de montaje completo de alta calidad. Generalmente, en los protocolos de inmunotinción, la retina se sumerge en fijadores químicos antes de ser incubada en anticuerpos. Los fijadores ideales no deben cambiar la forma de las células, la accesibilidad o afinidad de los epítopos por los anticuerpos, o las dimensiones lineales del tejido ^9,10.

Debido a la compleja estructura de la retina, problemas como la fragilidad retiniana y el plegamiento, así como algunas dificultades comunes, como la contracción celular y los núcleos poco claros, son propensos a ocurrir cuando se hace un parche retiniano de montaje completo, lo que tiene un impacto negativo en la investigación experimental. Además, no todas las retinas se inmunotiñen inmediatamente, especialmente cuando se trata de las retinas de ratones transgénicos con precios caros que son de origen precioso, lo que requiere la preservación de las muestras de retina adicionales para su uso posterior.

La solución fijadora adecuada puede fijar el tejido rápidamente, evitar la autólisis tisular, preservar la morfología y estructura normales de las células tisulares y mantener la antigenicidad de las proteínas y otras sustancias¹⁰. En la actualidad, la fijación a base de formaldehído se ha utilizado ampliamente en diversos tejidos, incluyendo retinas separadas, oculares hemisecados y globos oculares enteros¹⁰. La contracción del tejido y la alteración morfológica de las células son los dos desafíos críticos encontrados después de la inmersión en formaldehído¹¹. Además, las formulaciones de fijación modificada están emergiendo cada vez más para maximizar la retención de las propiedades originales de la retina y las células diana ^9,10. Diferentes tratamientos de fijación retiniana pueden afectar la estructura retiniana, la inmunogenicidad de proteínas, la excitación fluorescente y el ciclo de enfriamiento de atenuación de manera diferente^12,13. Las retinas fijadas con la solución de Davidson están más morfológicamente intactas en comparación con las fijadas con formalina, pero la solución de Davidson es menos compatible con algunos anticuerpos, como la molécula adaptadora de unión al calcio ionizada del marcador microglial 1¹². Teniendo en cuenta la naturaleza frágil de las retinas, los investigadores naturalmente se preguntarían si la integridad de la retina, así como las propiedades y la morfología de las células diana, cambiarán después del almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, rara vez se han informado los posibles efectos de la solución de fijación sobre la morfología de las células retinianas y RGC después del almacenamiento durante varios meses. La optimización de la fijación retiniana es crítica para la evaluación y preservación de las CGR.

Proporcionamos una descripción detallada de un método confiable y técnicamente sencillo que utilizamos para la tinción retiniana murina de montaje completo. Nuestro método enfatiza la preparación y almacenamiento adecuados de las retinas para la investigación de RGC, teniendo en cuenta la necesidad de almacenamiento a largo plazo del tejido retiniano, así como aspectos específicos de la formación o degradación de fluoróforos.