FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol
Summary
Burada sunulan, fare uzuv kas uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) izolasyonu için, hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT &RUN) kullanılarak salım yoluyla kas liflerinde transkripsiyon regülasyonu çalışmasına uyarlanmış etkili bir protokoldür.
Abstract
Küçük hücre popülasyonları ile genom çapında analizler, özellikle kök hücre alanındaki çalışmalar için büyük bir kısıtlamadır. Bu çalışma, yüksek yapısal protein içeriğine sahip bir doku olan ekstremite kasından uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) izolasyonu için etkili bir protokolü açıklamaktadır. Yetişkin farelerden alınan disseke ekstremite kasları, dispas ve tip I kollajenaz ile takviye edilmiş besiyerinde kıyma ile mekanik olarak bozuldu. Sindirimden sonra, homojenat hücre süzgeçlerinden süzüldü ve hücreler FACS tamponunda süspanse edildi. Canlılık, sabitlenebilir canlılık boyası ile belirlendi ve immün boyalı uydu hücreleri FACS ile izole edildi. Hücreler Triton X-100 ile parçalandı ve serbest bırakılan çekirdekler konkanavalin A manyetik boncuklarına bağlandı. Çekirdek/boncuk kompleksleri, ilgilenilen transkripsiyon faktörüne veya histon modifikasyonlarına karşı antikorlarla inkübe edildi. Yıkamalardan sonra, çekirdek/boncuk kompleksleri protein A-mikrokok nükleazı ile inkübe edildi ve CaCl2 ile kromatin bölünmesi başlatıldı. DNA ekstraksiyonundan sonra, kütüphaneler oluşturuldu ve dizilendi ve genom çapında transkripsiyon faktörü bağlanması ve kovalent histon modifikasyonları için profiller biyoinformatik analiz ile elde edildi. Çeşitli histon işaretleri için elde edilen pikler, bağlanma olaylarının uydu hücrelerine özgü olduğunu gösterdi. Ayrıca, bilinen motif analizi, transkripsiyon faktörünün, aynı kökenli yanıt elemanı aracılığıyla kromatine bağlı olduğunu ortaya çıkardı. Bu nedenle bu protokol, yetişkin farelerde uzuv kas uydu hücrelerinde gen regülasyonunu incelemek için uyarlanmıştır.
Introduction
İskelet çizgili kaslar, toplam insan vücudunun ağırlığının ortalama %40’ını temsil eder1. Kas lifleri, yeni oluşan miyositlerin füzyonu ve hasarlı olanların yerini alan yeni miyoliflerin üretilmesi ile tanımlanan yaralanma üzerine rejenerasyon için dikkate değer bir kapasite sergiler2. 1961’de Alexander Mauro, uydu hücreleri3 olarak adlandırdığı bir mononükleer hücre popülasyonu bildirdi. Bu kök hücreler, transkripsiyon faktörü eşleştirilmiş kutu 7’yi (PAX7) eksprese eder ve bazal lamina ile kas liflerininsarkolemması arasında bulunur 4. Farklılaşma kümesini 34 (CD34; hematopoietik, endotelyal progenitör ve mezenkimal kök hücre belirteci), integrin alfa 7 (ITGA7; pürüzsüz, kardiyak ve iskelet kası belirteci) ve ayrıca CXC kemokin reseptörü tip 4’ü (CXCR4; bir lenfosit, hematopoietik ve uydu hücresi belirteci) ifade ettikleri bildirilmiştir5. Bazal koşullarda, uydu hücreleri, onları hareketsiz bir durumda tutan belirli bir mikro ortamda bulunur6. Kas hasarı üzerine aktive olurlar, çoğalırlar ve miyojenez7’ye uğrarlar. Bununla birlikte, toplam kas hücresi sayısının sadece küçük bir kısmına katkıda bulunan genom çapındaki analizleri, özellikle fizyolojik ortamlarda (toplam hücrelerin% <1'i) özellikle zordur.
Uydu hücrelerinden kromatin izolasyonu için, kromatin immünopresipitasyonunu takiben büyük paralel dizileme (ChIP-seq) veya hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT & Tag) deneylerini içeren çeşitli yöntemler tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu iki teknik, tartışmasız kalan bazı önemli sınırlamalar sunmaktadır. Gerçekten de, ChIP-seq, sonikasyon adımı sırasında büyük bir kısmı kaybolan yeterli kromatin üretmek için yüksek miktarda başlangıç malzemesi gerektirir. CUT & Tag, düşük hücre sayısı için daha uygundur, ancak Tn5 transpozaz aktivitesi nedeniyle ChIP-seq’den daha fazla hedef dışı bölünme bölgesi oluşturur. Ek olarak, bu enzim açık kromatin bölgeleri için yüksek bir afiniteye sahip olduğundan, CUT & Tag yaklaşımı, susturulmuş heterokromatin8,9 yerine, genomun aktif olarak kopyalanan bölgeleriyle ilişkili histon modifikasyonlarını veya transkripsiyon faktörlerini analiz etmek için tercihen kullanılabilir.
Burada, fare uzuv kas uydu hücrelerinin FACS ile hedeflerin altında bölünme için izolasyonuna ve nükleaz (CUT & RUN)10,11 analizi kullanılarak serbest bırakılmasına izin veren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Çeşitli adımlar, dokunun mekanik olarak bozulmasını, hücre sıralamasını ve çekirdek izolasyonunu içerir. Yöntemin, canlı bir hücre süspansiyonunun hazırlanmasına ilişkin etkinliği, kovalent histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörleri için CUT & RUN analizi yapılarak gösterilmiştir. İzole edilmiş hücrelerin kalitesi, tarif edilen yöntemi, doğal genomik doluluk durumunu aslına uygun olarak yakalayan kromatin hazırlamak için özellikle çekici kılar ve kromozom konformasyonunu, spesifik lokuslarda (4C-dizilimi) veya genom çapında seviyelerde (Hi-C) yüksek verimli dizileme ile kombinasyon halinde yakalamak için uygun olması muhtemeldir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, fare uydu hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için standartlaştırılmış, güvenilir ve gerçekleştirmesi kolay bir yöntemin yanı sıra CUT & RUN yöntemi ile transkripsiyonel regülasyonun değerlendirilmesini bildirmektedir.
Bu protokol birkaç kritik adımı içerir. Birincisi, çok sayıda toplanan hücreyi sağlamak için kas bozulması ve lif sindirimidir. Artan enzim konsantrasyonuna rağmen, Protokol 1 kullanılandan daha fazla canlı hücre elde edildi. Uydu h…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mükemmel teknik yardım sağladığı için Anastasia Bannwarth’a teşekkür ederiz. IGBMC hayvan barınağı tesisine, hücre kültürüne, Fare Klinik Enstitüsü’ne (ICS, Illkirch, Fransa), görüntülemeye, elektron mikroskobuna, akış sitometrisine ve ‘France Génomique’ konsorsiyumunun (ANR-10-INBS-0009) bir üyesi olan GenomEast platformuna teşekkür ederiz.
Strazburg Üniversitesi, CNRS ve Inserm’in ITI 2021-2028 programının bir parçası olarak Disiplinlerarası Tematik Enstitüsü IMCBio’nun bu çalışması, Geleceğe Yönelik Fransız Yatırımları Programı çerçevesinde IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ve SFRI-STRAT’US projesi (ANR 20-SFRI-0012) ve EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) tarafından desteklenmiştir. INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon stratejik programı 24376 (DD’ye), INSERM genç araştırmacı hibesi (DD’ye), ANR-10-LABX-0030-INRT ve ANR tarafından Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02) çerçeve programı kapsamında yönetilen bir Fransız Devlet fonu tarafından ek finansman sağlandı. J.R., Université franco-allemande ve Ministère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’Innovation’dan CDFA-07-22 Programı ve K.G. Association pour la Recherche à l’IGBMC (ARI) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
Referenzen
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
- Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
- Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
- Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
- Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
- Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
- Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
- Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
- Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
- Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
- Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
- Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
- Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
- Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
- Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
- Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
