FACS-पृथक माउस उपग्रह कोशिकाओं के CUT &RUN विश्लेषण के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल
Summary
यहां प्रस्तुत माउस अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल है जो लक्ष्य के तहत दरार द्वारा मांसपेशी फाइबर में प्रतिलेखन विनियमन के अध्ययन के लिए अनुकूलित है और न्यूक्लियस (कट एंड रन) का उपयोग करके रिलीज करता है।
Abstract
छोटे सेल आबादी के साथ जीनोम-व्यापक विश्लेषण अध्ययन के लिए एक प्रमुख बाधा है, खासकर स्टेम सेल क्षेत्र में। यह काम अंग की मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, संरचनात्मक प्रोटीन की उच्च सामग्री वाला ऊतक। वयस्क चूहों से विच्छेदित अंग की मांसपेशियों को यांत्रिक रूप से डिस्पैस और टाइप 1 कोलेजनेस के साथ पूरक माध्यम में घुमाकर बाधित किया गया था। पाचन पर, होमोजेनेट को सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था, और कोशिकाओं को एफएसीएस बफर में निलंबित कर दिया गया था। व्यवहार्यता को ठीक करने योग्य व्यवहार्यता दाग के साथ निर्धारित किया गया था, और इम्यूनोस्टेन्ड उपग्रह कोशिकाओं को एफएसीएस द्वारा अलग किया गया था। कोशिकाओं को ट्राइटन एक्स -100 के साथ जोड़ा गया था और जारी नाभिक को कोनकानावेलिन ए चुंबकीय मोतियों से बांधा गया था। न्यूक्लियस /बीड कॉम्प्लेक्स को प्रतिलेखन कारक या रुचि के हिस्टोन संशोधनों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। धोने के बाद, न्यूक्लियस / बीड कॉम्प्लेक्स को प्रोटीन ए-माइक्रोकोकल न्यूक्लियस के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और क्रोमैटिन क्लीवेज को सीएसीएल2 के साथ शुरू किया गया था। डीएनए निष्कर्षण के बाद, पुस्तकालयों को उत्पन्न और अनुक्रमित किया गया था, और जीनोम-वाइड ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बाइंडिंग और सहसंयोजक हिस्टोन संशोधनों के लिए प्रोफाइल जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण द्वारा प्राप्त किए गए थे। विभिन्न हिस्टोन चिह्नों के लिए प्राप्त चोटियों से पता चला कि बाध्यकारी घटनाएं उपग्रह कोशिकाओं के लिए विशिष्ट थीं। इसके अलावा, ज्ञात आकृति विश्लेषण ने खुलासा किया कि प्रतिलेखन कारक अपने आत्मीय प्रतिक्रिया तत्व के माध्यम से क्रोमैटिन से बंधा था। इसलिए यह प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं में जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित है।
Introduction
कंकाल धारीदार मांसपेशियां कुलमानव शरीर के वजन का औसतन 40% प्रतिनिधित्व करती हैं। मांसपेशी फाइबर चोट पर पुनर्जनन के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जिसे नवगठित मायोसाइट्स के संलयन और नए मायोफाइबर की पीढ़ी द्वारा वर्णित किया जाता है जोक्षतिग्रस्त लोगों को प्रतिस्थापित करते हैं2। 1961 में, अलेक्जेंडर माउरो ने मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की आबादी की सूचना दी जिसे उन्होंने उपग्रह कोशिका3 कहा। ये स्टेम सेल प्रतिलेखन कारक युग्मित बॉक्स 7 (पैक्स 7) को व्यक्त करते हैं, और बेसल लैमिना और मांसपेशी फाइबर4 के सरकोलेममा के बीच स्थित होते हैं। उन्हें भेदभाव 34 (सीडी 34; एक हेमटोपोइएटिक, एंडोथेलियल पूर्वज और मेसेनकाइमल स्टेम सेल मार्कर), इंटीग्रिन अल्फा 7 (आईटीजीए 7; एक चिकनी, हृदय और कंकाल की मांसपेशी मार्कर), साथ ही सी-एक्स-सी केमोकाइन रिसेप्टर टाइप 4 (सीएक्ससीआर 4; एक लिम्फोसाइट, हेमटोपोइएटिक और सैटेलाइट सेल मार्कर) के क्लस्टर को व्यक्त करने की सूचना दी गई थी। बेसल स्थितियों में, उपग्रह कोशिकाएं एक विशेष माइक्रोएन्वायरमेंट में रहती हैं जो उन्हें एकस्थिर अवस्था में रखती हैं। मांसपेशियों की क्षति पर, वे सक्रिय हो जाते हैं, प्रसार करते हैं, और मायोजेनेसिस7 से गुजरते हैं। हालांकि, मांसपेशियों की कोशिकाओं की कुल संख्या के केवल एक मामूली अंश में योगदान करते हुए, उनके जीनोम-व्यापी विश्लेषण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, खासकर शारीरिक सेटिंग्स (कुल कोशिकाओं का <1%) के तहत।
उपग्रह कोशिकाओं से क्रोमैटिन अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसमें क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन शामिल है, जिसके बाद बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण (CHIP-seq) या लक्ष्य और टैगेशन (CUT &tag) प्रयोगों के तहत दरार शामिल है। फिर भी, ये दो तकनीकें कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं प्रस्तुत करती हैं जो निर्विवाद रहती हैं। दरअसल, CHIP-seq को पर्याप्त क्रोमैटिन उत्पन्न करने के लिए उच्च मात्रा में प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता होती है, जिसका एक बड़ा हिस्सा सोनिकेशन चरण के दौरान खो जाता है। कट एंड टैग कम सेल संख्या के लिए अधिक उपयुक्त है, लेकिन टीएन 5 ट्रांसपोसेस गतिविधि के कारण सीएचआईपी-सेक की तुलना में अधिक ऑफ-टारगेट क्लीवेज साइट्स उत्पन्न करता है। इसके अलावा, चूंकि इस एंजाइम में ओपन-क्रोमैटिन क्षेत्रों के लिए एक उच्च संबंध है, इसलिए सीयूटी एंड टैग दृष्टिकोण का उपयोग हेटेरोक्रोमैटिन 8,9 के बजाय जीनोम के सक्रिय रूप से स्थानांतरित क्षेत्रों से जुड़े हिस्टोन संशोधनों या प्रतिलेखन कारकों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो एफएसीएस द्वारा माउस अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है ताकि लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लियस (कट एंड रन) 10,11 विश्लेषण का उपयोग करके रिलीज किया जा सके। विभिन्न चरणों में ऊतक, सेल सॉर्टिंग और नाभिक अलगाव के यांत्रिक व्यवधान शामिल हैं। एक व्यवहार्य सेल निलंबन की तैयारी के संबंध में विधि की दक्षता, सहसंयोजक हिस्टोन संशोधनों और प्रतिलेखन कारकों के लिए कट एंड रन विश्लेषण करके प्रदर्शित की गई थी। पृथक कोशिकाओं की गुणवत्ता वर्णित विधि को क्रोमैटिन तैयार करने के लिए विशेष रूप से आकर्षक बनाती है जो मूल जीनोमिक अधिभोग स्थिति को ईमानदारी से पकड़ती है, और विशिष्ट लोकी (4 सी-सेक) या जीनोम-वाइड स्तरों (एचआई-सी) पर उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ संयोजन में गुणसूत्र रचना को पकड़ने के लिए उपयुक्त होने की संभावना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन माउस उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक मानकीकृत, विश्वसनीय और आसानी से प्रदर्शन करने वाली विधि की रिपोर्ट करता है, साथ ही साथ कट एंड रन विधि द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए अनास्तासिया बानवर्थ को धन्यवाद देते हैं। हम आईजीबीएमसी पशु घर सुविधा, सेल कल्चर, माउस क्लिनिकल इंस्टीट्यूट (आईसीएस, इलकिर्च, फ्रांस), इमेजिंग, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, फ्लो साइटोमेट्री और जेनोमईस्ट प्लेटफॉर्म को धन्यवाद देते हैं, जो ‘फ्रांस जेनोमिक’ कंसोर्टियम (एएनआर -10-आईएनबीएस -0009) का सदस्य है।
इंटरडिसिप्लिनरी थीमैटिक इंस्टीट्यूट आईएमसीबीआईओ का यह काम, स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय, सीएनआरएस और इनसेरम के आईटीआई 2021-2028 कार्यक्रम के हिस्से के रूप में, आईडीएक्स यूनिस्ट्रा (एएनआर -10-आईडीईएक्स -0002) और एसएफआरआई-स्ट्रैट’यूएस परियोजना (एएनआर 20-एसएफआरआई-0012) और यूरो आईएमसीबीआईओ (एएनआर -17-यूरो -002) द्वारा समर्थित था। आईएनएसईआरएम, सीएनआरएस, यूनिस्ट्रा, आईजीबीएमसी, एजेंस नेशनल डे ला रेचरचे (एएनआर-16-सीई11-0009, एआर2जीआर), एएफएम-टेलेथन रणनीतिक कार्यक्रम 24376 (डीडी को), आईएनएसईआरएम युवा शोधकर्ता अनुदान (डीडी को), एएनआर -10-एलएबीएक्स-0030-आईएनआरटी और एएनआर द्वारा प्रबंधित एक फ्रांसीसी राज्य निधि द्वारा अतिरिक्त वित्त पोषण प्रदान किया गया था। जे.आर. को यूनिवर्सिटी फ्रैंको-एलेमांडे और मिनिस्टेरे डी एल’एनसेग्नेमेंट सुपेरिअर डी ला रेचरचे एट डी एल’इनोवेशन से प्रोग्राम सीडीएफए-07-22 द्वारा समर्थित किया गया था, और केजी को एसोसिएशन ऑफ ला रेचरचे ए एल’आईजीबीएमसी (एआरआई) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
Referenzen
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
- Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
- Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
- Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
- Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
- Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
- Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
- Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
- Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
- Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
- Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
- Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
- Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
- Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
- Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
- Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
