Explantes cocleares neonatales enteros como modelo in vitro

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos del Comité de Bienestar Animal del Cantón de Basilea, Suiza. Para los experimentos se utilizaron ratones C57BL/6JR postnatales, ratas Wistar y ratones deficientes en STAT1 (mezcla C57BL/6-129/SvEv)7 de 3 a 5 días de edad y de ambos sexos. 1. Recubrimiento de las cámaras de pocillos múltiples Preparar el medio de cultivo completo.Para los explantes de órganos de Corti, prepare un medio que contenga el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS) al 10%, 25 mM de HEPES y 30 U/mL de penicilina. Para los explantes de órganos de Corti y los explantes cocleares, prepare un medio que contenga DMEM/F12, 1 suplemento de N2, 1 suplemento de B27 menos antioxidantes y 30 U/ml de penicilina. Prepare una solución madre de poli-D-lisina añadiendo 10 ml de agua de cultivo celular a 5 mg de poli-D-lisina en una campana laminar. La concentración final de poli-D-lisina es de 0,5 mg/mL.NOTA: Alicuone la solución madre restante y guárdela a -20 °C.Prepare las soluciones de trabajo de poli-D-lisina diluyendo la solución madre 1:10 en agua estéril. Cubra una cámara de 8 pocillos con 150 μL/pocillo de solución de trabajo de poli-D-lisina e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.NOTA: Si se utiliza una cámara de 4 pocillos, cubra con 300 μL/pocillo de solución de trabajo de poli-D-lisina. Aspire la solución por vacío o pipeteo. Lavar 2 veces con 200 μL de agua estéril y una vez con 200 μL de medio de cultivo completo o DMEM. Añadir 150 μL de medio de cultivo completo a cada pocillo.NOTA: Si se utiliza una cámara de 4 pocillos, agregue 250 μL/pocillo de medio de cultivo completo. Coloque la cámara en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante al menos 30 minutos antes de colocar un explante. 2. Disección del hueso temporal Desinfecte la mesa quirúrgica con etanol al 70% y esterilice todos los instrumentos en un esterilizador de microesferas de vidrio. Coloque una placa de Petri estéril de 60 mm en un balde que contenga hielo. Vierta unos mililitros de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y manténgala en hielo.NOTA: Use 30 U/mL de penicilina en 1x PBS para evitar la contaminación bacteriana. Coloque una almohadilla estéril en una bandeja estéril y decapite rápidamente al cachorro con unas tijeras de operación. Sumerja el cabezal en etanol al 70% durante 5 segundos, si la contaminación es un evento frecuente.NOTA: Este protocolo se probó en ratones y ratas de P3 a P5. Los tejidos cocleares son más difíciles de diseccionar en ratones y ratas más viejos, y la supervivencia de los explantes en cultivo es limitada. Coloque la cabeza del animal sobre una almohadilla estéril. Retira la mandíbula. Levanta la piel y retírala del cráneo. Sostenga el cráneo colocando las pinzas en las cavidades orbitarias. Corta con cuidado el cráneo a lo largo de la sutura sagital y luego corta en el área de la sutura coronal con una hoja de bisturí afilada sin dañar la cóclea.NOTA: Evite aplicar demasiada presión y evite los movimientos hacia adelante y hacia atrás con el bisturí, ya que esto puede dañar el hueso coclear y, por lo tanto, el conducto coclear. Retire con cuidado el cerebro de las dos mitades del cráneo. Transfiera las mitades del cráneo a una placa de Petri de 60 mm con el PBS helado preparado en el paso 2.3. 3. Aislamiento de la cóclea Localice la cóclea en el hueso temporal bajo el microscopio. Coloque las pinzas en el canal semicircular superior. Afloje el tejido circundante entre la cóclea y el hueso temporal con una jeringa de insulina (ratones) o fórceps (ratas). Tire con cuidado del hueso temporal para separarlo de la cóclea, manteniendo la cóclea unida al vestíbulo con el hueso temporal. Asegúrese de que la cóclea esté libre del tejido circundante antes de empujar el hueso temporal hacia un lado.NOTA: Aplicar demasiada fuerza dañará el conducto coclear. Sostenga la cóclea en una posición fija y use la otra mano para retirar con cuidado la cápsula coclear cartilaginosa. Inserte con cuidado las puntas de las pinzas en la región del ápice o entre las vueltas (visible como una línea blanca) y retire la cápsula pieza por pieza. Exponga el conducto coclear. Coloque con cuidado las pinzas debajo de la cóclea y sepárelas del órgano vestibular y del hueso temporal. Transfiera la cóclea a un nuevo plato de 60 mm que contenga PBS helado. Ajuste el aumento del microscopio para visualizar mejor los explantes. Siga los siguientes pasos para el órgano de los explantes de Corti:Sostenga el órgano en la base con fórceps. Retire suavemente el conducto coclear agarrándolo con pinzas en la región del gancho basal. Desenrolle el conducto coclear del modiolo sin romperlo. Retire con cuidado el ligamento espiral con la estría vascular sosteniendo el órgano en la base y tirando de él.NOTA: La separación de tejidos también se puede lograr sosteniendo la región del ápice en lugar de la región de la base. Esto puede ser útil cuando se diseccionan órganos de ratas o crías de ratón mayores (>P5). Retire con cuidado la membrana de Reissner sosteniendo el órgano en la base y tirando de él pieza por pieza.NOTA: Este es un paso opcional ya que la membrana de Reissner no interfiere con la adquisición de las imágenes. Siga los siguientes pasos para los explantes cocleares:Separe el ganglio espiral de la lámina espiral ósea con una jeringa de insulina (ratones) o fórceps (ratas). Desenrolle suavemente el modiolo durante el desprendimiento.NOTA: Los explantes se pueden dividir en dos piezas para un mejor manejo. Sujete la región del gancho con fórceps. Retire con cuidado el ligamento espiral con la estría vascular tirando de él. Retire con cuidado la membrana de Reissner sosteniendo el órgano en la base y tirando de él pieza por pieza.NOTA: Se recomienda este paso, porque la membrana de Reissner generalmente se pliega y cubre los filamentos de la neurona y, por lo tanto, podría afectar los experimentos. 4. Cultivo de explantes cocleares Transfiera los explantes de la placa de Petri a las cámaras de pocillos múltiples. Levante los explantes con las células ciliadas hacia arriba con una espátula de laboratorio. Incluya unos microlitros de 1x PBS para evitar que las muestras se peguen a la espátula.NOTA: Los explantes severamente dañados se pegarán a la espátula. Deje que los explantes se deslicen de la espátula hacia la cámara agitando suavemente la espátula en el medio. Coloque un explante por pocillo de un portaobjetos de cámara de 8 pocillos.NOTA: Si el explante se pega a la espátula, sostenga la espátula en el medio y use las pinzas para separar los explantes. Coloque siempre las pinzas en el borde interno del explante (lejos de las células ciliadas). Verifique bajo el microscopio que los explantes hayan sido transferidos en la orientación correcta y colocados en el centro de los pocillos.NOTA: Los explantes mal orientados con células ciliadas hacia abajo tienden a mostrar una forma de U hacia arriba a lo largo de su ancho. Corrija su orientación moviendo los explantes a las esquinas de las cámaras (hay más medio disponible) y diríjalos a girar. Retire 80 μL del medio con una pipeta de 100 μL y deséchelo. Verifique bajo el microscopio si las células ciliadas y las células de la neurona ganglionar espiral son visibles. Si es necesario, use fórceps para separar suavemente algunos tejidos superpuestos. Retire el resto del medio y espere ~ 10 s. Pipetea la parte media hacia atrás. Agregue una o dos gotas del medio junto al explante y el resto del medio a cierta distancia del explante para evitar que el explante se desprenda.NOTA: Incluso si los explantes están adheridos a las cámaras, el medio siempre debe agregarse primero pipeteando una o dos gotas junto a los explantes. De esta manera, los explantes no se levantarán cuando se agreguen los medios completos restantes. Regrese la cámara a la incubadora e incube durante 2 h para permitir que los órganos se adhieran firmemente al fondo de la cámara. Retire el medio y agregue con cuidado 300 μL de medio completo fresco precalentado con una pipeta de 100 μL o 200 μL. No utilice una pipeta de 1 ml.NOTA: Si se desea un pretratamiento, después de 2 h de fijación, añadir 300 μL de medio completo que contenga la sustancia de interés. Si se utiliza una cámara de 4 pocillos, utilice hasta 500 μL/pocillo. Regrese las cámaras a la incubadora. 5. Ensayo de agentes ototóxicos Deje los explantes durante la noche para que se adapten a las condiciones de cultivo y se recuperen. Preparar diferentes concentraciones de agentes ototóxicos para encontrar la concentración adecuada para establecer un modelo ototóxico con aproximadamente un 50% de pérdida de células ciliadas. Utilizar entre 50 μM y 250 μM para gentamicina y entre 40 μM y 320 μM para cisplatino. Prepare las soluciones de cisplatino frescas y protéjalas de la luz. Retire el medio y agregue con cuidado 300 μL de medio que contenga el fármaco ototóxico deseado. Incubar los explantes con gentamicina y cisplatino a 37 °C durante 24 h a 48 h para determinar la supervivencia de las células ciliadas.NOTA: Las concentraciones del fármaco y el tiempo de exposición se eligen en función del propósito del estudio. La conservación de los explantes se probó aquí hasta 72 h. No use suero si planea realizar un cultivo a largo plazo. Siga la siguiente sección para teñir las células cocleares. 6. Fijación e inmunofluorescencia Deseche el medio al final del experimento e inmediatamente lave los explantes con 200 μL de PBS precalentado 1x. Fijar los explantes con 200 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min bajo una campana de extracción química.PRECAUCIÓN: El PFA es un producto químico peligroso; lea la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) antes de trabajar con PFA por primera vez. Lavar los explantes dos veces con 200 μL de 1x PBS. Almacenar los explantes en 1x PBS a 4 °C en caso de que sea necesario posponer los procedimientos de tinción. Prepare la solución de permeabilización que consiste en 1x PBS y 1%-5% Triton-X100. Deseche el 1x PBS, agregue 200 μL de solución de permeabilización e incube los explantes durante 15 min. Prepare la solución de bloqueo.Para el órgano de los explantes de Corti, prepare una solución de bloqueo que consista en 1x PBS, suero de cabra normal al 10% (NGS, para anticuerpos secundarios de cabra, u otro suero de la misma especie que los anticuerpos secundarios). Alternativamente, use albúmina sérica bovina (BSA) al 1%-5% si las células se tiñen solo con faloidina. En el caso de los explantes cocleares, prepare una solución de bloqueo que consista en 1x PBS, 10 % de NGS y fragmento Fab (Fab fragment goat-anti mouse IgG H+L, dilución 1:200) si se utilizan anticuerpos primarios de ratón (p. ej., anti-TuJ1 de ratón) para teñir las células ganglionares espirales. Añadir 200 μL de solución de bloqueo e incubar los explantes durante 1 h. Deseche la solución de bloqueo. A los explantes incubados con el fragmento Fab, añadir 200 μL de PFA al 4%, e incubar durante 5 min. Lavar los explantes con 1x PBS durante 5 min. Prepare una solución de anticuerpos que consista en 1x PBS, 5% de NGS y 0,1%-0,25% de Triton-X100. Diluir el anticuerpo primario en una solución de anticuerpos, MYO7A (ab3481 a una dilución de 1:500 o MYO7A 138-1 a 1:100), para etiquetar las células ciliadas y TuJ1 (1:400) para etiquetar las neuronas ganglionares espirales.NOTA: Si las células ciliadas solo están marcadas con faloidina, diluya la faloidina a 1:150 en 1x PBS, incube durante 40 minutos a 1 hora a temperatura ambiente y continúe con el paso 6.22. Incluir un control de la unión inespecífica del anticuerpo secundario omitiendo el anticuerpo primario. Añadir 170 μL de la solución de anticuerpos con el anticuerpo primario al pocillo correspondiente, e incubar durante la noche a 4 °C con una suave agitación (40-60 rpm). Lave los explantes 4 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS. Diluya el anticuerpo secundario en una solución de anticuerpos (p. ej., Alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra o Alexa Fluor 568 IgG anti-ratón de cabra a una dilución de 1:500). Añadir 170 μL de la solución de anticuerpos con el anticuerpo secundario e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.NOTA: A partir de este paso, proteja los explantes de la exposición prolongada a la luz. Lave los explantes 2 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS. Continúe con el siguiente paso para el doble etiquetado secuencial de los explantes. Incubar con un segundo anticuerpo primario de interés (por ejemplo, MYO7A para células ciliadas) durante la noche a 4 °C con una agitación suave (40-60 rpm). Alternativamente, incubar con faloidina (1:150) durante 40 min a 1 h a temperatura ambiente, y continuar con el paso 6.22.NOTA: Realice el marcaje secuencial si los anticuerpos primarios son de la misma especie huésped. Realice el marcaje de faloidina al final para la inmunofluorescencia multiplex. Lave los explantes 4 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS. Diluya el anticuerpo secundario en una solución de anticuerpos (p. ej., Alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra o Alexa Fluor 568 IgG anti-ratón de cabra a una dilución de 1:500). Añadir 170 μL del anticuerpo secundario e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Lave los explantes 2 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS. Preparar una solución madre DAPI de 1 mg/ml y conservar a -20 °C. Diluir la solución madre DAPI 1:10 para preparar soluciones de trabajo de 0,1 mg/ml y almacenar a 4 °C.NOTA: Omita el paso 23 y vaya al paso 26 si se utiliza el medio de montaje que contiene DAPI. Diluir la solución de trabajo DAPI 1:100 en 1x PBS, e incubar los explantes con 200 μL de solución DAPI durante 5 min. Lave los explantes 2 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS. Retire el 1x PBS tanto como sea posible para permitir que el fondo de la cámara se seque. No dejes que el explante se seque. Espere de 2 a 5 segundos y agregue una gota de medio de montaje directamente sobre el explante.NOTA: El medio de montaje en el explante permanecerá en su lugar debido a la tensión superficial. Se puede utilizar un medio de montaje de endurecimiento. Almacene las cámaras a 4 ° C hasta la obtención de imágenes. 7. Inmunofluorescencia de células vivas a partir de explantes Utilice los explantes aislados después de la incubación durante la noche. Retire el medio y agregue con cuidado 300 μL de medio que contenga 125 μM de cisplatino. Incubar los explantes durante 18 h para medir el superóxido mitocondrial en los explantes vivos. Deseche el medio al final de la exposición al medicamento. Agregue 300 μL de una sonda permeable para detectar las ROS celulares (p. ej., 250 nM de mitohidroetidina) y/o Caspasa-3 (p. ej., 2 μM de péptido DEVD conjugado con un colorante de unión a ácidos nucleicos). Incubar a 37 °C durante 30 min. Lavar los explantes dos veces suavemente con 200 μL de solución salina balanceada de Hank tibia (HBSS) o un tampón adecuado. Obtenga imágenes de las células en 2 h con excitación de fluorescencia a 400 nm y detección de emisiones a 590 nm. Deseche el medio al final del experimento e inmediatamente lave los explantes con 200 μL de PBS precalentado 1x. Fije los explantes y tiña las células cocleares como se ha descrito anteriormente. 8. Visualización por imagen confocal Tome imágenes de los explantes utilizando un microscopio equipado con una unidad confocal de disco giratorio o un microscopio confocal equipado con una unidad confocal de barrido puntual. Adquiera las imágenes utilizando un disco giratorio con un objetivo de aire de 20x (apertura numérica: 0,75) para el recuento de células. Alternativamente, adquiera las imágenes utilizando un microscopio confocal de barrido puntual con un objetivo de aire de 40x (apertura numérica: 0,95) o un objetivo de aceite de 100x (apertura numérica: 1,45) para visualizar y contar las sinapsis o obtener imágenes de los estereocilios.NOTA: Ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición para cada canal para evitar la sobresaturación o la subsaturación de las imágenes. Aplique la misma configuración a todos los explantes del mismo experimento. Configure el microscopio para capturar una imagen en 3D de todo el explante coclear utilizando un objetivo de aire de 20x, una pila en Z y herramientas de costura automáticas. Utilice campos adyacentes de 3 x 3 con un 15% de superposición para los explantes de ratón y 4 x 4 campos adyacentes para los explantes de ratas que se van a coser. Ajuste las imágenes utilizando el software del microscopio o el software gratuito de código abierto FIJI8.NOTA: La deconvolución, una técnica de procesamiento de imágenes, se puede aplicar a imágenes confocales para agudizar su contraste y resolución 9-11.