Fabricación de micropartículas poliméricas pulsátiles que encapsulan el antígeno de la rabia

1. Generación de moldes maestros de partículas NOTA: El proceso de impresión 3D se puede realizar con cualquier impresora 3D con suficiente resolución espacial; sin embargo, el protocolo actual describe el proceso para una impresora 3D multifotónica. Diseñe estructuras de micropartículas utilizando un programa de diseño asistido por computadora (CAD).NOTA: Las especificaciones de diseño son las siguientes: 308 partículas (diámetro = 400 μm, altura = 500 μm y espesor de pared = 100 μm) están dispuestas en una matriz de 22 por 14, con 600 μm de espacio entre ellas. El diseño también contiene una estrella de cuatro puntas y una estrella de cinco puntas como fiduciarios inmediatamente fuera de la matriz (Figura suplementaria 1). Exporte el diseño final como un archivo STL (Supplementary Coding File 1) y cargue el archivo en un software capaz de definir los parámetros de impresión como se muestra a continuación. Luego, guárdelo como un archivo compatible con la impresora 3D (consulte Tabla de materiales).NOTA: Distancia de corte = 5 μm, distancia de rayado = 1 μm, contorno de la carcasa = 50 μm, recuento de cortes base = 5 μm, andamios = hueco, modo de escaneo = galvo, eje z = unidad z del microscopio, velocidad de escaneo = 100,000, potencia = 100. Pre-tratar un sustrato de impresión de silicio (ver Tabla de materiales) usando un proceso de limpieza por plasma (gas: O2; potencia: 200 vatios; temperatura: 25 °C; flujo: 20; tiempo: 5 min), luego sumergir inmediatamente el sustrato en una solución de 30 ml de etanol y 60 μl de 3-(trimetoxisilil) metacrilato de propilo en una placa de Petri de vidrio. Cubrir con papel de aluminio y dejar incubar durante la noche.NOTA: Este paso aumenta la adhesión de la impresión al sustrato, lo cual es importante durante la separación PDMS (paso 2.6). Cargue el archivo de impresión en la impresora 3D multifotónica, aplique la resina de impresión al sustrato tratado, cargue la lente 10x (consulte Tabla de materiales) e imprima las microestructuras. Una vez terminado, sumerja la impresión en acetato de éter metílico de propilenglicol (consulte la Tabla de materiales) durante 45 minutos para eliminar la fotorresistencia no expuesta, luego sumerja la impresión en alcohol isopropílico durante 5 minutos. Post-curado del molde maestro exponiéndolo a la luz UV a 254 nm durante 120 min.NOTA: Si está disponible, la luz UV en el rango de 405 a 365 nm se puede utilizar durante ~ 20 minutos para post-curar las estructuras impresas. 2. Generación de moho de polidimetilsiloxano (PDMS) Trate la superficie del molde maestro impreso en 3D colocándolo en una cámara de vacío que contenga un portaobjetos de vidrio con 40 μL de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluorooctil) (consulte la Tabla de materiales) silano agregado a la superficie. Tire del vacío (presión relativa: -20 in. Hg) durante 1 h.NOTA: Este paso garantiza una fácil separación al desmoldear (paso 2.6). Mientras se trata la superficie del molde maestro, mezcle bien la base del prepolímero de polidimetilsiloxano (PDMS) con el agente de curado de prepolímero PDMS en una proporción de 9: 1 por masa (se necesitan al menos 10 g de material para cada molde maestro). Una vez bien mezclado, transfiera el PDMS sin curar a un tubo de centrífuga de 50 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Una vez que se complete el tratamiento de la superficie, coloque el molde maestro en un plato de papel de aluminio y vierta el PDMS sin curar sobre el molde, asegurándose de que las características estén completamente sumergidas. Coloque el plato de papel de aluminio en una cámara de vacío y tire del vacío (presión relativa: -20 in. Hg) durante 1 h para eliminar las burbujas de aire. Retire el plato de papel de aluminio de la cámara de vacío. Coloque espaciadores de 800 μm en los extremos del molde maestro y superponga un tobogán de vidrio limpio sobre el molde maestro, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire. Utilice clips aglutinantes para sujetar el molde y la corredera juntos, localizando la fuerza de sujeción sobre los espaciadores (Figura complementaria 2). Coloque la estructura en un horno a 120 °C durante al menos 4 h para curar el prepolímero en moldes PDMS. Retire la estructura del horno, suelte con cuidado los clips aglutinantes y separe cuidadosamente el molde maestro del molde PDMS curado con una cuchilla de afeitar.NOTA: El molde maestro impreso en 3D se puede reutilizar para generar moldes PDMS adicionales. 3. Fabricación de películas PLGA Pesar 450 mg de PLGA (consulte la Tabla de materiales) y colóquelo en una lámina de polímero antiadherente de 76 mm por 76 mm dentro de una cuña de anillo de 250 μm de espesor, con un diámetro interior de 50,8 mm. Coloque una segunda lámina de polímero antiadherente sobre el PLGA y comprima la pila entre dos bloques de aluminio con una abrazadera C de 101,6 mm hasta que quede apretada con los dedos.NOTA: 502H PLGA se utilizó exclusivamente en este estudio; sin embargo, otros tipos de PLGA son compatibles con este proceso. Coloque el conjunto con sujeción en C en un horno de vacío ajustado a 120 °C durante 30 minutos al vacío, con una presión relativa de -30 in.Hg. Luego, retire el conjunto y apriete firmemente la abrazadera antes de volver a colocarla en el horno de vacío durante otros 30 minutos.NOTA: El propósito principal de usar una aspiradora es evitar la degradación de PLGA, que se acelera a altas temperaturas. Retire el conjunto del horno y déjelo enfriar durante 4 h en un desecador. Una vez que esté fría, afloje la abrazadera, retire la película PLGA de las láminas de polímero antiadherente y coloque la película en una placa de Petri etiquetada. Guarde la placa de Petri dentro de un desecador para su uso posterior. 4. Generación de partículas PLGA Trate la superficie del molde PDMS como se describió anteriormente en el paso 2.1. Usando pinzas y/o un bisturí, corte y coloque una porción de la película PLGA de 250 μm, aproximadamente del tamaño de la matriz, en el molde PDMS tratado. Superponga un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio sobre la película PLGA y el molde PDMS y sujete los componentes colocando una abrazadera de resorte directamente sobre la matriz y la película PLGA. Coloque el conjunto de molde sujeto en el horno de vacío ajustado a 120 ° C y tire del vacío con una presión relativa de -30 pulgadas. Hg durante 1 h.NOTA: El tiempo necesario para formar las partículas depende del PLGA, y puede variar de 1 a 12 h. Retire el conjunto de molde sujetado del horno y déjelo enfriar pasivamente a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos, o hasta que se enfríe al tacto. Con una cuchilla de afeitar, aplique presión suavemente entre el molde PDMS y la matriz de partículas PLGA para separar los dos. Almacene las partículas de PLGA en un desecador para su uso futuro. 5. Concentración y purificación de antígenos Descongele una alícuota del antígeno RABV disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) a temperatura ambiente. Ensamble la configuración de filtración colocando dos filtros centrífugos de centrifugado con un corte de peso molecular de 100 kDa (MWCO; consulte la Tabla de materiales) en dos tubos de recolección. Prehumedezca los dos filtros centrífugos de centrifugado añadiendo 500 μL de agua UltraPure. Haga girar los filtros a 2.400 x g durante 1 minuto en una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente. Retire el agua de los compartimentos superior e inferior de la configuración de filtración utilizando una pipeta de 200 μL.NOTA: No deje que el filtro de centrifugado prehumedecido se seque. Añadir 400 μL de agua destilada al compartimento superior de cada filtro de centrifugado, añadir a continuación 100 μL del antígeno RABV descongelado y mezclar con la pipeta.NOTA: Este estudio concentró el antígeno aproximadamente cinco veces y redujo la concentración de excipientes <100 kDa en ~ 50 veces. Cargue los dos filtros centrífugos de centrifugado en una centrífuga de sobremesa, asegurándose de que los filtros miren hacia el centro de la centrífuga. Marque qué lado del filtro mira hacia el centro de la centrífuga.NOTA: Si se orientan incorrectamente, las soluciones no se filtrarán / concentrarán correctamente. Centrifugar los filtros a 14.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Recupere los filtros de la centrífuga. Los tubos de recolección contendrán el filtrado, mientras que los filtros contendrán la muestra concentrada (Figura complementaria 3A). Retire el filtrado de los tubos de recogida con una pipeta y deséchelo. Agregue 450 μL de agua destilada filtrada a cada filtro y mezcle la muestra concentrada y el agua pipeteando hacia arriba y hacia abajo seis veces. Centrifugar los dos filtros de centrifugado por segunda vez a 14.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que los filtros miran hacia el centro de la centrífuga en la misma orientación que en el paso 5.7. Recupere las unidades filtrantes de la centrífuga y, al igual que antes, retire y deseche el filtrado de cada tubo con una pipeta. Retire los filtros de centrifugado de los tubos de recogida y tape las carcasas del filtro utilizando la parte superior de los tubos de recogida (figura complementaria 3B). Coloque la parte inferior de las carcasas del filtro de centrifugado directamente sobre un vórtice y un vórtice a 3.000 rpm durante 30 s mientras mantiene las carcasas del filtro en posición vertical y en ángulos de 45° (Figura complementaria 3C).NOTA: Este paso está destinado a resuspender cualquier antígeno RABV que formó un pellet durante el proceso de centrifugación. Retire con cuidado la tapa de los tubos de recolección de las carcasas del filtro de centrifugado. Vuelva a colocar las carcasas del filtro en los tubos de recolección provistos y realice un giro rápido (2-3 s) para recoger cualquier volumen que pueda haber quedado atrapado en la tapa.NOTA: Este giro rápido debe realizarse en una microcentrífuga de sobremesa. Los filtros deben ser tangenciales a la centrífuga, opuestos a la configuración anterior, para garantizar que no se pierda solución a través de los filtros. Invierta cada unidad de filtro de centrifugado en un nuevo tubo de recolección provisto con el kit de filtro de centrifugado (consulte la Tabla de materiales) y centrifugar durante 2 minutos a 1,000 x g a temperatura ambiente para recolectar las muestras concentradas. Consolide las muestras concentradas de los dos tubos de recolección en un tubo de recolección. Mida y registre el volumen resultante.NOTA: La muestra resultante tendrá 5 veces la concentración inicial de antígeno que el stock, tendrá una pequeña concentración de excipiente (<100 kDa) aproximadamente 50 veces menor que el stock y aparecerá ligeramente blanca lechosa. El volumen total debe ser de aproximadamente 44-48 μL. Conservar el antígeno concentrado lavado dos veces a 4 °C hasta el momento de la dispensación, pero no más de 16 h. Antes de llenar las partículas con esta solución, centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 1 minuto para eliminar cualquier burbuja. La solución podrá diluirse con agua destilada para alcanzar la concentración nominal prevista para la dispensación. 6. Relleno de partículas Filtre al vacío 500 ml de agua desionizada a través de un filtro de vacío de 0,22 μm, luego desgasifique la solución aplicando un vacío (presión relativa: -20 in. Hg) mientras estaba bajo sonicación durante 20 min. Durante este tiempo, conecte los capilares de dispensación piezoeléctrica (PDC; consulte la Tabla de materiales) al dispensador piezoeléctrico. Prepare la máquina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales) y coloque la diapositiva con las partículas de PLGA en el área de dispensación. Configure “Buscar puntos de referencia de destino”, Ejecutar y, a continuación, configure el “Sustrato de destino”, de acuerdo con la Figura complementaria 4. Cargue 25 μL del antígeno concentrado en la placa fuente y cárguelo en la máquina. Usando las PDC, aspire 10 μL de antígeno concentrado en la punta de dispensación, lave el exterior de la punta y luego calibre la alineación de dispensación (Figura complementaria 5). Introduzca “Parámetros de configuración de destino” y haga clic en Ejecutar (Figura complementaria 6). Una vez completado, retire las partículas llenas y verifique que estén llenas bajo un estereoscopio. Vaya directamente al siguiente paso del protocolo. 7. Sellado y recolección de partículas Coloque un bloque de acero inoxidable (consulte la Tabla de materiales) en una placa calefactora. Coloque dos portaobjetos de microscopio en el bloque de acero inoxidable para que queden paralelos. Asegúrese de que el bloque de acero inoxidable esté nivelado, luego encienda la placa calefactora y ajuste la temperatura para que la temperatura de la superficie del acero inoxidable sea de 200 ° C. Verifique la temperatura de la placa calefactora antes de sellarla. Suspenda las partículas de PLGA llenas por encima de la placa calefactora colocándolas en los dos portaobjetos de vidrio y, a continuación, inicie inmediatamente un temporizador durante 18 s.NOTA: La cantidad de tiempo y partículas de calor necesarias para sellar variará dependiendo de las propiedades químicas del PLGA utilizado para hacer las partículas. Se puede usar un soporte de diapositivas impreso en 3D personalizado para manejar las diapositivas a una distancia segura de la placa calefactora. El archivo STL se proporciona como archivo de codificación suplementario 2. Una vez sellada, retire la matriz de partículas de la placa calefactora y colóquela sobre el banco de laboratorio colocando la matriz de partículas en dos portaobjetos de vidrio separados. Deje que las partículas se enfríen durante 1 minuto. Una vez enfriadas, las partículas se pueden cosechar usando un bisturí mientras se mira a través de un estereoscopio. Sostenga el bisturí con la cuchilla en un ángulo de 45° con respecto al portaobjetos y aplique presión a la base de la partícula para separarla del portaobjetos de vidrio. Una vez cosechadas, use el bisturí para transferir las partículas a tubos de unión de 0,5 ml bajos en proteínas (consulte la Tabla de materiales). Luego, llene los tubos con 250 μL de una solución tampón fosfato (PBS) 1x que contenga 30 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 mg/ml de glucosa.NOTA: La solución de glucosa de 30 mg/ml de BSA y 1 mg/ml preparada en PBS mantendrá la estabilidad del antígeno RABV. Aplaste las partículas bajo un estereoscopio usando un par de pinzas de punta fina. Asegúrese de que el antígeno RABV en el núcleo de la partícula esté disponible para disolverse en la solución circundante. Guarde las muestras en una nevera a 4 °C hasta que se pueda evaluar la potencia del antígeno mediante un ELISA. Las muestras deben ejecutarse en un ELSIA dentro de los 7 días posteriores a la preparación. 8. Evaluación del antígeno por ELISA PRECAUCIÓN: No deje que las microplacas se sequen en ningún momento. Siempre apile los platos y siempre cubra la placa superior con un sello de plástico, un plato vacío o una tapa para evitar que se seque. Prepare los búferes como se indica en el Archivo complementario 1. Preparar 5 ml de solución de recubrimiento (tampón de carbonato-bicarbonato, pH 9.6) a una concentración de 2.5 μg/ml agregando 25 μL del anticuerpo de recubrimiento a 4975 μL de tampón de recubrimiento a pH 9.4-9.6.NOTA: Se necesitan 5 ml para recubrir 96 pocillos con 50 μL cada uno (con volumen adicional para la pérdida de pipeteo). Aumente el volumen total en 5 ml por cada placa ELISA adicional necesaria. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 50 μL de la solución de recubrimiento en cada pocillo de la microplaca. La solución debe usarse para el recubrimiento inmediatamente después de prepararla. Golpee suavemente a lo largo de los bordes de la placa en una palma enguantada para asegurarse de que el fondo de cada pocillo esté cubierto uniformemente con líquido. Selle la placa con una película adhesiva y colóquela a 37 °C durante 1 h, luego transfiérala a 4 °C durante la noche. Recupere las placas de la cámara frigorífica y lávelas tres veces con 200 μL de tampón de lavado en cada pocillo. Retire el tampón de lavado y dispense 300 μL de tampón de bloqueo en cada pocillo.PRECAUCIÓN: Cuando se repiten varias placas con las mismas muestras en diferentes placas, es importante proceder placa por placa (es decir, llenar la placa 1 con el material antes de proceder a la placa 2, y luego a la placa 3 y así sucesivamente). No aplique el material X a todas las placas y luego el material Y, etc., ya que esto aumentaría el riesgo de que los pozos se sequen. Después del paso final de lavado, el tampón de lavado debe permanecer en los pocillos de la placa y solo desecharse inmediatamente antes de agregar muestras a la placa. Se debe usar una tapa de placa de plástico de 96 pocillos para cubrir todos los pocillos de la placa ELISA que no se dispensan de inmediato, y la tapa se mueve secuencialmente para revelar pozos adicionales que se llenarán con material. Selle las placas con una película plástica adhesiva (consulte la Tabla de materiales) y colóquelas en una incubadora durante 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C. Preparar la curva estándar y las muestras de ensayo que se evaluarán durante esta incubación.NOTA: El antígeno que se está evaluando debe diluirse previamente en tampón diluyente a una dilución recomendada de 0,125 UI/ml, con un exceso de volumen de al menos 40 μL para tener en cuenta la pérdida de pipeteo. Todas las muestras se evalúan por duplicado (dos réplicas técnicas) en cada placa ELISA. Para la curva estándar, se debe incluir una serie de dilución doble para un total de ocho puntos en las columnas 2 y 3 de cada placa ELISA. Se puede realizar una serie de dilución para todas las demás muestras con un número apropiado de puntos basado en la cantidad prevista de antígeno que se está evaluando. Aunque es menos riguroso para un mayor rendimiento, se puede utilizar una sola dilución de muestra como alternativa al recubrimiento descrito anteriormente. Sin embargo, la concentración esperada de una sola dilución debe estar dentro del rango de curva estándar. En placas de proteína de bajo enlace de 96 pocillos, o tubos de proteína de baja unión (consulte la Tabla de materiales), realice una serie de dilución doble de cada muestra a lo largo de las columnas de la placa. Cargue el inicio de la serie de dilución en la fila A para cada muestra respectiva al doble del volumen final requerido (por placa, se requieren 100 μL de muestra por pocillo, por lo que todos los pocillos en A2-A11 deben contener al menos 240 μL de una muestra, con un volumen adicional de 40 μL para tener en cuenta la pérdida de pipeteo). Cargue 120 μL de tampón diluyente en todos los demás pocillos de la placa de proteína de baja unión, excluyendo las columnas 1 y 12 (es decir, B2 a H11). Utilizando una pipeta multicanal cargada con 10 puntas, realice una dilución en serie transfiriendo 120 μL de muestra de A2-A11 a B2-B11 y pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar evitando salpicaduras y burbujas. Repita este proceso, moviéndose por la placa a lo largo de las columnas hasta los pozos H2-H11. Deseche el volumen restante de 120 μL aspirado de la última fila de pocillos.NOTA: Las muestras ya están listas para su análisis. Si la fase de bloqueo no se ha completado en este momento, asegúrese de que las muestras se mantengan en hielo. Al final de la etapa de incubación, lave las placas tres veces con 200 μL de tampón de lavado. Utilizando una pipeta multicanal, transfiera 100 μL de tampón diluyente a las columnas 1 y 12 como “espacios en blanco”. Usando una pipeta multicanal, transfiera 100 μL de cada pocillo de la placa de 96 pocillos de proteína de baja unión que contiene diluciones de muestra a la placa ELISA lavada. Repita el procedimiento para todas las placas ELISA que se estén ejecutando. Selle las placas con una película plástica adhesiva y colóquelas en una incubadora durante 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C. Preparar la solución de anticuerpos de detección (ver Tabla de materiales) a una concentración de 0,2 μg/ml añadiendo 4,4 μL de la solución de anticuerpos a 10.995,6 μL del tampón diluyente y mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.NOTA: Se necesita un total de 11 ml para 96 pozos de 100 μL cada uno (con volumen adicional para pérdidas de pipeteo). Aumente el volumen total en 11 ml por cada placa ELISA adicional que se evalúe. La solución debe utilizarse inmediatamente después de la preparación. Al final de la etapa de incubación, lave las placas cinco veces con 200 μL de tampón de lavado. Aspirar el tampón de lavado restante y dispensar 100 μL de la solución de anticuerpos de detección en cada pocillo de la microplaca utilizando una pipeta multicanal. Selle las placas con una película plástica adhesiva y colóquelas en una incubadora durante 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C. Prepare el conjugado hacia el final de la etapa de incubación de anticuerpos de detección agregando 4.4 μL de solución conjugada de estreptavidina-peroxidasa (ver Tabla de materiales) a 10,995.6 μL de tampón de lavado.NOTA: Se necesita un total de 11 ml para 96 pocillos de 100 μL cada uno (con volumen adicional para pipeteo multicanal). Aumente el volumen total en 11 ml por cada placa ELISA adicional que se evalúe. Lave las placas cinco veces con 200 μL de tampón de lavado. Aspirar el tampón de lavado restante y dispensar 100 μL de la solución conjugada en cada pocillo. Selle las placas con una película plástica adhesiva y colóquelas en una incubadora a 37 °C durante 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C. Prepare el sustrato durante el paso final de lavado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Para cada placa, disuelva una tableta de diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD; consulte la Tabla de materiales) en 9 ml de agua desionizada en la oscuridad, luego rellene con 1 ml de tampón de peróxido estable 10x. Ajustar el número de comprimidos y el volumen total de solución (10 ml) según el número de placas evaluadas. Lave las placas cinco veces con 200 μL de tampón de lavado. Dispensar 100 μL del sustrato a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. Selle las placas con una película plástica adhesiva y déjelas en el banco durante 10-20 minutos, protegidas de la luz, utilizando papel de aluminio.NOTA: Supervise visualmente el desarrollo del color para evitar la saturación. Añadir 50 μL de solución de parada a cada pocillo y la placa de lectura inmediatamente para una absorbancia a 492 nm y una absorbancia de referencia de 620 nm. Analice los datos utilizando la lectura de absorbancia corregida (lectura a 492 nm menos la lectura a 620 nm) y reste el promedio del espacio en blanco de todas las muestras. Utilice un método de interpolación sigmoidal 4PL para convertir los valores de absorbancia a UI/ml. Finalmente, multiplique por los 250 μL (volumen total de la muestra) para convertir a UI.NOTA: Este análisis se puede realizar utilizando software de análisis de datos.