Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

Entstehende diskoidale High-Density-Lipoproteine (HDLs) sind natürlich vorkommende Vorläufer des weitaus häufiger vorkommenden sphärischen HDL, das im menschlichen Kreislaufsystem vorkommt. Diese entstehenden Partikel, die auch als prä-ß-HDL bezeichnet werden, besitzen einzigartige und unverwechselbare strukturelle Eigenschaften¹. Tatsächlich existieren die entstehenden HDLs nicht als kugelförmige Partikel, sondern sind scheibenförmig. Umfangreiche strukturelle Charakterisierungsstudien an natürlichen und rekonstituierten diskoidalen HDLs haben gezeigt, dass sie aus einer Phospholipiddoppelschicht bestehen, deren Umfang durch ein amphipathisches austauschbares Apolipoprotein (apo), wie z.B. apoA-I, begrenzt ist. Im humanen Lipoproteinstoffwechsel akkumulieren zirkulierende naszierende HDLs Lipide aus peripheren Zellen und reifen zu kugelförmigen HDLs in einem Prozess, der von wichtigen Proteinmediatoren abhängig ist, darunter der ATP-bindende Kassettentransporter A1 und Lecithin:Cholesterin-Acyltransfers². Dieser Prozess stellt eine wichtige Komponente des umgekehrten Cholesterintransportwegs dar, der als Schutz vor Herzerkrankungen gilt. Ausgestattet mit diesem Wissen und der Fähigkeit, diskoidale HDLs zu rekonstruieren, haben Forscher diese Partikel als therapeutische Intervention zur Behandlung von Atherosklerose^{eingesetzt 3}. Im Wesentlichen fördert die Infusion von rekonstituiertem HDL (rHDL) in Patienten den Cholesterinausfluss aus Plaqueablagerungen und gibt es zur Leber zurück, wo es in Gallensäuren umgewandelt und aus dem Körper ausgeschieden wird. Mehrere Biotechnologie-/Pharmaunternehmen verfolgen diese Behandlungsstrategie⁴.

Gleichzeitig hat die Möglichkeit, diese Partikel im Labor zu erzeugen, eine Flut von Forschungsaktivitäten ausgelöst, die zu neuartigen Anwendungen und neuen Technologien geführt haben. Eine prominente Anwendung ist die Verwendung von rHDL-Partikeln als Miniaturmembran zur Unterbringung von Transmembranproteinen in einer nativen Umgebung⁵. Bis heute wurden Hunderte von Proteinen erfolgreich in diskoidales rHDL eingebaut, und die Forschung hat gezeigt, dass diese Proteine sowohl die native Konformation als auch die biologische Aktivität als Rezeptoren, Enzyme, Transporter usw. beibehalten. Es hat sich auch gezeigt, dass diese Partikel, die als “Nanodiscs” bezeichnet werden, für eine strukturelle Charakterisierung geeignet sind, oft mit hoher Auflösung⁶. Dieser Ansatz zur Untersuchung von Transmembranproteinen gilt als überlegen gegenüber Studien mit Detergenzienmizellen oder Liposomen und schreitet daher rasch voran. Es ist wichtig zu erkennen, dass zwei verschiedene Methoden beschrieben wurden, die in der Lage sind, eine rHDL zu bilden. Die “Cholatdialyse”-Methode¹³ ist beliebt für Anwendungen, die mit dem Einbau von Transmembranproteinen in die rHDL-Doppelschicht⁵ zusammenhängen. Im Wesentlichen beinhaltet dieses Formulierungsverfahren das Mischen einer Doppelschicht, die ein Phospholipid, ein Gerüstprotein bildet, und das interessierende Transmembranprotein in einem Puffer, der das Detergens Natriumcholat (oder Natriumdesoxycholat; Mizellenmolekulargewicht [MW] von 4.200 Da) enthält. Das Detergens löst die verschiedenen Reaktionskomponenten effektiv auf, so dass die Probe gegen Puffer ohne Detergens dialysiert werden kann. Während des Dialyseschritts, wenn das Detergen aus der Probe entfernt wird, bildet sich spontan ein rHDL. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, um ein Transmembranprotein von Interesse einzufangen, wurden die Produktpartikel als Nanoscheiben⁵ bezeichnet. Versuche, mit dieser Methode niedermolekulare hydrophobe bioaktive Wirkstoffe (MW <1.000 Da) einzubauen, blieben jedoch weitgehend erfolglos. Im Gegensatz zu Transmembranproteinen sind niedermolekulare bioaktive Wirkstoffe in der Lage, zusammen mit dem Detergens aus dem Dialysebeutel zu entweichen, was ihre Inkorporationseffizienz in rHDLs stark verringert. Dieses Problem wurde gelöst, indem Detergenzien aus der Formulierungsmischung¹⁴ weggelassen wurden. Stattdessen werden die Komponenten nacheinander in einen wässrigen Puffer gegeben, beginnend mit der Doppelschicht, die ein Lipid bildet, wodurch ein stabiler bioaktiver Wirkstoff entsteht, der rHDL enthält, der als Nanodisk bezeichnet wird. Andere haben rHDL für den Einbau und Transport von In-vivo-Bildgebungsmitteln ^{verwendet 7}. In jüngerer Zeit wurden spezialisierte rHDL, bestehend aus einem Apolipoprotein-Gerüst und dem anionischen Glycerophospholipid Cardiolipin, in Ligandenbindungsstudien eingesetzt. Diese Partikel bieten eine Plattform für Studien zur Wechselwirkung von Cardiolipin mit verschiedenen wasserlöslichen Liganden, darunter Calcium, Cytochrom c und das Krebsmittel Doxorubicin⁸.

Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt auf der Formulierung von rHDL, die einen stabil eingebauten hydrophoben bioaktiven Wirkstoff (d.h. Nanodisk) besitzen. Die Fähigkeit dieser Wirkstoffe, sich in das Lipidmilieu von scheibenförmigen rHDL-Partikeln zu integrieren, verleiht ihnen effektiv eine wässrige Löslichkeit. Daher haben Nanoscheiben das Potenzial für therapeutische Anwendungen in vivo . Bei der Formulierung von Nanoscheiben sind bestimmte Inkubations-/Reaktionsbedingungen erforderlich, um diskrete hydrophobe bioaktive Wirkstoffe erfolgreich in das Produktpartikel einzubauen, und das Ziel dieses Berichts ist es, detaillierte praktische Informationen bereitzustellen, die als grundlegende Vorlage für die Herstellung neuartiger Nanoscheibenpartikel für bestimmte Anwendungen verwendet werden können. Daher sind die Begriffe Nanodisc und Nanodisk im Kontext dieses Manuskripts nicht austauschbar. Während sich Nanodisc auf ein rHDL bezieht, das so formuliert ist, dass es ein Transmembranprotein enthält, das in seine Lipiddoppelschicht⁵ eingebettet ist, bezieht sich der Begriff Nanodisk auf ein rHDL, das so formuliert ist, dass es hydrophobe bioaktive Wirkstoffe mit niedrigem Molekulargewicht (< 1.000 Da), wie z. B. Amphotericin B¹⁴, enthält.

Für die Gewinnung geeigneter Gerüstproteine stehen eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung. Es ist möglich, Gerüstproteine von Herstellern zu kaufen [z. B. apoA-I (SRP4693) oder apoE4 (A3234)], jedoch können die Kosten ein limitierender Faktor sein. Ein bevorzugter Ansatz ist die Expression rekombinanter Gerüstproteine in Escherichia coli. Es wurden Protokolle für humane apoA-I⁹, apoE4¹⁰ sowie das Insekten-Hämolymphprotein Apolipophorin-III¹¹ veröffentlicht. Für die Zwecke der hierin beschriebenen Experimente wurde eine rekombinante humane apoE4 N-terminale (NT) Domäne (Aminosäuren 1-183) verwendet. Die Nukleotidsequenz, die für humanes apoE4-NT kodiert, wurde synthetisiert und in einen pET-22b (+) Expressionsvektor eingefügt, der direkt an die vektorkodierte pelB-Leader-Sequenz angrenzt. Dieses Konstrukt führt zur Expression eines pelB-Leader-Sequenz-apoE4-NT-Fusionsproteins. Nach der Proteinsynthese leitet die bakterielle pelB-Leader-Sequenz das neu synthetisierte Protein in den periplasmatischen Raum, wo die Leader-Peptidase die pelB-Sequenz spaltet. Das resultierende apoE4-NT-Protein ohne Sequenzmarkierungen oder Schwänze entweicht anschließend den Bakterien und reichert sich im Nährmedium^11,12 an^, was die nachgelagerte Verarbeitung vereinfacht.