该协议描述了显微注射和 体内 电穿孔,用于小鼠输卵管中区域限制的CRISPR介导的基因组编辑。
种系基因工程小鼠模型(G-GEMMs)为 体内基因在 发育、稳态和疾病中的功能提供了有价值的见解。然而,与菌落创建和维护相关的时间和成本很高。CRISPR介导的基因组编辑的最新进展允许通过直接靶向感兴趣的细胞/组织/器官来产生体细胞GEMM(S-GEMMs)。
输卵管或人类输卵管被认为是最常见的卵巢癌、高级别浆液性卵巢癌 (HGSC) 的起源组织。HGSC始于子宫远端的输卵管区域,位于卵巢附近,但不是输卵管近端。然而,传统的HGSC小鼠模型针对整个输卵管,因此不能概括人类的状况。我们提出了一种将DNA,RNA或核糖核蛋白(RNP)溶液显微注射到输卵管腔和 体内 电穿孔的方法,以靶向沿输卵管限制区域的粘膜上皮细胞。这种方法在癌症建模中有几个优点,例如1)靶向电穿孔区域/组织/器官和区域具有高适应性,2)与Cas9表达的特异性启动子结合使用时,靶向细胞类型(细胞柔韧性)具有高灵活性,3)电穿孔细胞数量的高灵活性(相对较低的频率), 4)不需要特定的小鼠系(免疫功能疾病建模),5)基因突变组合的高度灵活性,以及6)与Cre报告基因系结合使用时跟踪电穿孔细胞的可能性。因此,这种具有成本效益的方法概括了人类癌症的发生。
输卵管,在小鼠中称为输卵管,是一种连接子宫和卵巢的管状结构。它在哺乳动物繁殖中起着至关重要的作用,为内部受精和植入前发育提供了环境1,2。尽管它很重要,但对其功能和稳态知之甚少,部分原因是体外受精技术的发展规避了与该器官有关的任何不孕症问题3。然而,已经认识到高级别浆液性卵巢癌 (HGSC) 的癌前病变,这是一种侵袭性卵巢癌组织型,约占卵巢癌的 75%和相关死亡的 85%4,仅限于远端输卵管上皮 5,6,7,8 .这表明并非我们体内的所有细胞都同样容易受到致癌损伤的影响,而是只有每个组织/器官中的独特/易感细胞才能成为癌症的起源细胞 – 称为细胞柔韧性9。沿着这些思路,已经表明,位于卵巢附近的远端输卵管的上皮细胞与输卵管的其余部分不同10,11。因此,针对输卵管中所有细胞的传统HGSC小鼠模型并不能概括人类的状况。在最近的一项研究中,我们结合使用CRISPR介导的基因组编辑,体内输卵管电穿孔和基于Cre的谱系追踪,通过突变远端小鼠输卵管中的四个肿瘤抑制基因来成功诱导HGSC12,13。本手稿提供了一个分步方案,描述了这种显微注射和体内电穿孔程序,以靶向小鼠输卵管粘膜上皮。
这种方法有几个优点。它可以适应于靶向其他组织/器官,包括器官实质14。虽然其他体内基因递送方法(如慢病毒和腺病毒系统)可用于实现类似的组织/器官特异性靶向,但使用不同尺寸的镊子型电极进行基于电穿孔的递送更容易调整靶向区域。根据DNA/RNA/核糖核蛋白(RNP)的浓度、电穿孔参数和电极的大小,可以改变电穿孔细胞的数量。此外,当与Cas9表达的促进剂结合使用时,可以靶向特定的细胞类型,而无需绝对需要种系基因工程小鼠模型(G-GEMMs)。此外,与病毒递送系统不同,电穿孔允许将多个质粒递送到单个细胞中,并且对插入片段DNA大小15的限制较小。由于这种高度的灵活性,基因突变的体内筛选也可以相对容易地进行。此外,当该方法与Cre报告细胞系(例如Tdtomato或Confetti16,17)结合使用时,可以跟踪或追踪电穿孔细胞。
该详细方案中的关键步骤是将DNA/RNA/RNP溶液显微注射到输卵管腔中,并控制电穿孔强度和面积。显微注射过程中的DNA/RNA/RNP溶液泄漏可能导致转染不需要的区域/细胞。为了一致和有效地电穿孔,最好用溶液填充输卵管腔(图3C,D)。这是因为电穿孔的面积主要由电极尺寸和位置控制。弱电穿孔会减少电穿孔细胞的数量,而苛刻的电穿孔可能会导致不需要的细胞电穿孔或破坏组织结构。电穿孔细胞的数量可以通过调整DNA/RNA/RNP溶液浓度或电穿孔参数来改变。然而,由于电穿孔过程中的高电压/热量产生可能会损坏组织,因此在活/麻醉小鼠使用之前应测试这些参数。最后,由于该程序的要求很高,建议在对活/麻醉小鼠进行此手术之前,对死小鼠进行道暴露和显微注射。
人们认识到,癌症的发生涉及多个基因,因此,概括这一事件需要对几个基因进行多等位基因修饰。此外,众所周知,并非所有细胞都同样容易受到致癌突变的影响9。因此,癌症建模需要特定的Cre小鼠系来实现对致癌损伤的严格控制。然而,它们的可用性和特异性带来了各种挑战,包括对非靶向组织的影响和致死性19。此外,传统的G-GEMM会产生高昂的维护成本,并且需要时间来生成鼠标系。CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展和特定体细胞基因递送的改进使我们能够克服这些问题。在该协议中,我们提出了一种用于体细胞基因组操作的DNA / RNA / RNP递送方法,可用于癌症建模,而无需绝对需要特定的小鼠系12。通过将 DNA/RNA/RNP 溶液注射到管腔并使用不同尺寸的镊子型电极进行基于电穿孔的递送,靶向小鼠输卵管粘膜上皮的限制区域(图 4A-F)。这在模拟源自输卵管远端的 HGSC 的起始时特别有用。
所提出的显微注射和 体内 电穿孔方法对于靶向具有管腔的组织/器官具有高度通用性。使用这种方法也可以靶向器官实质14。病毒递送方法,如慢病毒和腺病毒系统,也可用于类似目的。然而,与病毒递送方法相比,电穿孔的优势在于:1)将多个质粒递送到单个细胞中,2)对插入片段尺寸15没有限制,以及3)易于控制递送区域和时间。此外,通过使用谱系特异性启动子可以提高靶向特异性。由于病毒包装的限制,这在病毒系统中有时很困难。
正如电穿孔的性质一样,电穿孔的上皮细胞随机散布着健康的、未经编辑的细胞(图4G)。然而,转基因和未修饰细胞中的这种嵌合体可能有利于研究癌症的发生,因为它概括了免疫功能正常的微环境中早期癌症起始的零星性质。电穿孔细胞的频率可以通过改变DNA/RNA/RNP溶液浓度和/或电穿孔参数来调节。将CRISPR-Cas介导的基因编辑与所提出的方案结合使用,可以轻松筛选多个基因并在靶基因中生成突变/等位基因组合的异质模式;这在模拟具有大量基因组改变的癌症(如HGSCS20,21)时特别有用。此外,通过在癌症进展期间对靶向基因进行测序,可以跟踪免疫功能小鼠中肿瘤和转移的体内克隆进化12。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Katie Teng和Matthew J. Ford博士提供的质粒,用于产生具有代表性的结果和方案优化。K.H.得到了魁北克-桑特研究基金会(FRQS)博士资助,Donnor基金会,Delta Kappa Gamma世界奖学金,生殖与发展研究中心(CRRD),Hugh E. Burke,Rolande&Marcel Gosselin和Alexander McFee研究生奖学金的支持。
0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
Analgesic | – | – | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) – Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
Eye lubricant | Alcon | – | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
Heating pad/disc | – | – | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
Shaver | – | – | Hair removal cream can also be used. |
Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |