다중 웰 미세전극 어레이에서 Human In Vitro Neural Cultures의 집속 초음파 신경 조절
Summary
여기에서는 인간 유도 만능 줄기 세포(HiPSC) 뉴런에 대한 집속 초음파의 신경 조절 효과를 모니터링하고 정량화할 수 있는 고처리량 시스템을 사용하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
집속 초음파(FUS)의 신경 조절 효과는 동물 모델에서 입증되었으며 FUS는 인간의 운동 및 정신 장애를 치료하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 그러나 FUS의 성공에도 불구하고 뉴런에 미치는 영향의 기저에 있는 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않아 FUS 매개변수를 조정하여 치료 최적화를 어렵게 만듭니다. 이러한 지식의 격차를 해소하기 위해 인간 유도 만능 줄기세포(HiPSC)에서 배양한 뉴런을 사용하여 체외에서 인간 뉴런을 연구했습니다. HiPSC를 사용하면 생리학적 및 병리학적 상태 모두에서 인간 특이적 신경 행동을 연구할 수 있습니다. 이 보고서는 HiPSC 뉴런에 대한 FUS의 신경 조절 효과를 모니터링하고 정량화할 수 있는 고처리량 시스템을 사용하기 위한 프로토콜을 제시합니다. FUS 매개변수를 변화시키고 제약 및 유전자 변형을 통해 HiPSC 뉴런을 조작함으로써 연구자들은 신경 반응을 평가하고 HiPSC 뉴런에 대한 FUS의 신경 조절 효과를 설명할 수 있습니다. 이 연구는 다양한 신경 및 정신 질환에 대한 안전하고 효과적인 FUS 기반 치료법 개발에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다.
Introduction
집속 초음파(FUS)는 밀리미터 미만의 분해능 1,2,3으로 센티미터 수준의 깊이에서 비침습적 자극을 가능하게 하는 유망한 신경 조절 방식입니다. 이러한 장점에도 불구하고 FUS의 임상적 영향은 제한적인데, 이는 부분적으로 작용 메커니즘에 대한 지식이 부족하기 때문입니다. 탄탄한 이론적 토대가 없으면 연구자와 임상의는 다양한 조건에서 개별 환자의 특정 요구를 충족시키기 위해 치료법을 조정하는 데 어려움을 겪습니다. Yoo et al.[4]이 제안한 저명한 이론은 기계감응성 이온 채널이 뉴런 활성화를 담당한다는 것을 시사합니다. 그러나 이 이론은 이러한 채널이 없는 인간 뇌 뉴런의 FUS 활성화를 설명하지 못한다5. 이러한 모호성은 치료 결과를 최적화하기 위한 FUS 매개변수의 조정을 배제하기 때문에 클리닉에서 FUS의 활용을 제한합니다.
이전의 관련 연구에서는 FUS를 뒷받침하는 생리학적 메커니즘을 조사하고 최적의 자극 매개변수를 결정하기 위해 다양한 접근 방식을 사용했습니다. 이 과정에서 중요한 단계는 피드백으로서의 뉴런 반응을 모니터링하는 것인데, 이는 칼슘이온 영상4, 광학 영상1 및 생체 외 전기생리학적 기록(예: 근전도6 또는 피부-신경 전기생리학7)과 같은 이온게이트 모니터링과 관련된 방법을 통해 달성할 수 있다. 그러나 이러한 연구의 대부분은 인간이 아닌 뉴런 또는 생체 내 접근 방식을 사용하며, 이는 차선의 제어로 인해 추가 분산을 유발할 수 있습니다. 대조적으로, 전극을 사용하여 체외 인간 유도 만능 줄기 세포(HiPSC) 뉴런에서 신경 신호를 측정하면 더 민감한 측정과 실험 환경에 대한 더 큰 제어가 가능합니다. 이 연구에서는 그림 1과 같이 FUS 자극 후 HiPSC 뉴런의 전기적 반응을 측정하기 위해 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 체외 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 지역 사회의 연구자들이 초음파 매개변수(예: 주파수, 파열 길이, 강도)를 변경할 때 신경 반응을 모니터링할 수 있도록 합니다. 또한 이 시스템은 물리적 자극(예: 온도, 압력 및 캐비테이션)8,9에 대한 신경 민감도를 높은 수준으로 제어할 수 있으며, 이는 뉴런의 이온 채널 기능을 유전적 및 약학적으로 조작할 수 있기 때문입니다(예: 가돌리늄을 사용하여 이온 채널을 억제함)10,11,12. 이 분자 수준 제어는 FUS의 신경 조절 효과 뒤에 있는 메커니즘을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 FUS 신경 조절 중 HiPSC의 신경 활동을 기록하는 데 사용할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 FUS 변환기 및 MEA 시스템으로 일반화할 수 있습니다. 설명된 프로토콜로 관찰된 결과를 복제하기 위해 연구원은 변환기의 초점이 MEA 웰의 바닥 면적보다 큰지 확인해야 합니다. 또한 서로 다른 신경 세포주를 사용하는 경우 필터 파라미터를 웰 내 세포에 대한 예상 주파수 응답에 맞게 조정해야 합니다. 대표적인 결과를 얻을 수 없는 경우 앞서 언급한 매개변수(예: 버스트 길이, 강도, 듀티 사이클 등)를 수정하는 것을 고려해야 합니다.
이 연구는 FUS 자극 후 발화율의 증가를 보여주었지만 결론을 내리기 전에 이 발견의 반복성을 입증하기 위해 더 많은 데이터를 수집해야 합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 직접 미세 전극 전류 신호 기록에서 비롯된 약점이 있는 MEA 시스템의 한계를 계승합니다. 뉴런과의 직접 접촉은 더 나은 감도를 제공하지만 세포를 변화시키고 측정 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, 우물의 크기가 작기 때문에, 우리 몸에는 신경 조절에 중요한 역할을 할 수 있는 말초 조직이 포함되어 있지 않다17. 이는 이 설정으로부터 도출된 결론의 적용 가능성을 생체 내 환경에 제한할 수 있다. 보다 복잡한 네트워크 응답을 연구하기 위해서는, 더 높은 채널 밀도의 MEA 시스템이 그 감도를 향상시키도록 설계되어야 한다18. 이 제안된 시스템에 대한 몇 가지 미래 방향이 확인되었는데, 여기에는 3D 갠트리를 사용하여 트랜스듀서를 고정하고 정확한 배치(19)를 보장하는 것이 포함된다. 개별 뉴런을 분류하기 위해 스파이킹 정렬 알고리즘(20 )을 이용하는 것을 포함하여, 후처리 알고리즘에 관한 추가적인 개선이 이루어질 수 있다. 이 과정은 FUS의 메커니즘에 대한 향후 연구에서 다중 단위 뉴런의 반응을 푸는 데 도움이 될 것입니다. 가장 중요한 것은 근본적인 메커니즘을 설명하기 위해 화학적, 전기적, 광학적 자극과 같은 추가 자극 방식을 통합하는 것이 필수적이라는 것입니다. 이러한 방법들은 특이적인 이온 채널(15 )을 억제하거나 막 특성(21)을 변형시킴으로써 뉴런의 특성 및 거동을 변화시킬 수 있다. 가설화된 신호 전달 경로 내에서 주요 인자를 조절함으로써 연구자들은 통제된 환경에서 각 인자의 기여도를 식별하고 궁극적으로 복잡한 상호 작용에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다.
전기 자극22 은 신경 조절을 위한 가장 확립된 기술 중 하나이며, 임상 및 연구 환경에서 성공적인 응용의 오랜 역사를 가지고 있습니다. 대조적으로, FUS와 광유전학(optogenetics)23 은 최근 몇 년 동안 주목을 받고 있는 비교적 새로운 양식이다. FUS의 주요 장점은 전기 자극 및 광유전학을 포함한 다른 기술로는 도달하기 어려울 수 있는 깊이에서 뉴런을 자극하는 비침습성과 능력입니다. 그러나 광유전학24와 마찬가지로 FUS는 파동 전파 및 관련 신경 반응 모델링과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 생체 내에서 조직의 이질적인 음향 특성의 복잡성을 포착하는 것은 어려울 수 있으며, 이는 압력장과 결과적으로 신경 반응의 불확실성으로 이어질 수 있습니다. 이러한 특성을 정확하게 모델링하는 데 어려움이 있기 때문에 특정 실제 응용 분야에 맞게 기술을 최적화할 때 어려움이 있습니다. 내재된 복잡성은 제어된 음향 강도 조건에서 반응을 직접 연구할 수 있도록 하기 때문에 이 연구에서 본 연구와 같은 체외 시스템의 중요성을 강조합니다.
결론적으로, 이 시스템은 인간 뉴런에 대한 FUS의 신경 조절 효과를 연구하기 위한 고처리량 체외 플랫폼을 제공합니다. 이 시스템을 사용하면 통제된 환경에서 다양한 수준과 유형의 자극에 노출될 때 인간 뉴런의 전기 반응을 측정하여 FUS의 작용 메커니즘을 탐색할 수 있습니다. 따라서 현장에서 일반적으로 사용되는 인간 및 동물 모델에 귀중한 보조 도구를 제공합니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
아미르 만바치(Amir Manbachi)와 니티쉬 타코르(Nitish Thakor)는 국방고등연구계획국(DAR N660012024075 PA)의 자금 지원을 인정합니다. 또한 Amir Manbachi는 미국 국립보건원(NIH)의 NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)에서 관리하는 Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research(ICTR)의 Clinical Research Scholars Program(KL2)의 자금 지원을 인정합니다. Nitish Thakor는 미국 국립보건원(NIH)의 자금 지원을 인정합니다: R01 HL139158-01A1 및 R01 HL071568-15.
Materials
| MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
| MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
| Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
| CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
| Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
| HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
| Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
| Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
| Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
| Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
| Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
| Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
| Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
| Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
| Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
| Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
| Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
| Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
| Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
| Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
| Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
| Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |
Referenzen
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