Vascularização Eficiente de Organoides Renais através do Transplante Intracelomico em Embriões de Galinha
Summary
Apresentamos aqui um protocolo detalhado para o transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha. Este método induz a vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias e pode ser usado para estudar esses processos de maneira eficiente.
Abstract
Os organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos contêm estruturas semelhantes a néfrons que se assemelham às do rim adulto até certo ponto. Infelizmente, sua aplicabilidade clínica é dificultada pela falta de uma vasculatura funcional e, consequentemente, maturação limitada in vitro. O transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha induz a vascularização por vasos sanguíneos perfundidos, incluindo a formação de capilares glomerulares, e aumenta sua maturação. Esta técnica é muito eficiente, permitindo o transplante e análise de um grande número de organoides. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para o transplante intracelomico de organoides renais em embriões de galinha, seguido da injeção de lectina fluorescentemente marcada para coloração da vasculatura perfundida e da coleta de organoides transplantados para análise de imagem. Este método pode ser usado para induzir e estudar a vascularização e maturação de organoides para encontrar pistas para melhorar esses processos in vitro e melhorar a modelagem de doenças.
Introduction
Organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) têm demonstrado potencial para estudos de desenvolvimento 1,2,3,4, triagem de toxicidade 5,6 e modelagem de doenças5,7,8,9,10,11,12,13. Entretanto, sua aplicabilidade para esses e eventuais transplantes clínicos é limitada pela falta de uma rede vascular. Durante o desenvolvimento renal embrionário, podócitos, células mesangiais e células endoteliais vasculares (CEs) interagem para formar a intrincada estrutura do glomérulo. Sem essa interação, a barreira de filtração glomerular, composta por podócitos, membrana basal glomerular (MBG) e CE, não pode se desenvolver adequadamente14,15,16. Embora os organoides renais in vitro contenham algumas CE, estas não formam uma rede vascular adequada e diminuem com o passar do tempo17. Portanto, não é surpreendente que os organoides permaneçam imaturos. O transplante em camundongos induz vascularização e maturação dos organoides renais 18,19,20,21. Infelizmente, este é um processo trabalhoso que é inadequado para a análise de um grande número de organoides.
Embriões de galinha têm sido utilizados para estudar vascularização e desenvolvimento há mais de um século22. São de fácil acesso, requerem baixa manutenção, não possuem sistema imunológico totalmente funcional e podem desenvolver-se normalmente após a abertura da casca do ovo23,24,25,26. Demonstrou-se que o transplante de organoides em sua membrana corioalantóide (CAM) leva à vascularização27. No entanto, a duração do transplante na MAC, bem como o nível de maturação do enxerto, são limitados pela formação de CAM, que leva até o 7º dia embrionário para ser concluída. Portanto, recentemente foi desenvolvido um método para vascularizar eficientemente e amadurecer organoides renais através do transplante intracelomico em embriões degalinha28. A cavidade celômica de embriões de galinha é conhecida desde a década de 1930 como um ambiente favorável para a diferenciação de tecidos embrionários29,30. Pode ser acessado no início do desenvolvimento embrionário e permite a expansão relativamente ilimitada do enxerto em todas as direções.
Este trabalho descreve um protocolo para o transplante de organoides renais derivados de hiPSC na cavidade celômica de embriões de galinha do dia 4. Este método induz vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias. A injeção de aglutinina culinaris fluorescentemente marcada (LCA) antes do sacrifício dos embriões permite a visualização dos vasos sanguíneos perfundidos dentro dos organoides através da microscopia confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste manuscrito, um protocolo para transplante intracelomico de organoides renais derivados de hiPSC em embriões de galinha é demonstrado. Após o transplante, os organoides são vascularizados por vasos sanguíneos perfundidos que consistem em uma combinação de CE derivada de organoides humanos e de frango. Estes se espalham por todo o organoide e invadem as estruturas glomerulares, possibilitando a interação entre as CE e os podócitos. Foi demonstrado anteriormente que isso leva a uma maior maturação das estr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a George Galaris (LUMC, Leiden, Holanda) por sua ajuda com a injeção de embrião de galinha. Agradecemos o apoio de Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy &Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Holanda) e Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Holanda). M. Koning é apoiado por «Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC». Este trabalho foi em parte apoiado pelo Leiden University Fund “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund” GWF2019-02. Este trabalho é apoiado pelos parceiros da Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) e Health Holland, Top Sector Life Sciences and Health. C.W. van den Berg e T.J. Rabelink são apoiados pelo Centro da Fundação Novo Nordisk para Medicina de Células-Tronco (reNEW), O Centro da Fundação Novo Nordisk para Medicina de Células-Tronco é apoiado por subsídios da Fundação Novo Nordisk (NNF21CC0073729).
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
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