Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular

A matriz extracelular (MEC) é um dos principais constituintes dos tecidos, representando seu componente não celular. Essa estrutura tridimensional (3D) não apenas fornece suporte físico para as células, mas também desempenha um papel crucial nos processos bioquímicos envolvidos no desenvolvimento dos organismos¹. A formação de uma MEC tecido-específica ocorre durante o desenvolvimento, como resultado das complexas interações entre as células e seus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra e extracelulares. A MEC é uma estrutura altamente dinâmica que sofre rearranjos químicos e mecânicos de forma espaço-temporal e impacta diretamente o destino das^células2. Uma das características mais notáveis da MEC é sua diversidade funcional, pois cada MEC tecidual apresenta uma combinação única de moléculas que fornecem diferentes topologias e propriedades adaptadas às células que contém¹.

A sinalização e o suporte da MEC são cruciais para o desenvolvimento e a homeostase e, quando interrompidos, podem levar a múltiplas condições patológicas ^3,4. Um exemplo é a distrofia congênita deficiente em LAMA2 (LAMA2-CMD), que é a forma mais comum de distrofia muscular congênita. O gene LAMA2 codifica a cadeia α2 da laminina, que está presente na laminina 211 e na laminina 221, e quando mutada pode levar à LAMA2-CMD ⁵. A laminina 211 é a principal isoforma encontrada na membrana basal que envolve as fibras musculares esqueléticas. Quando a laminina 211 é anormal ou ausente, a ligação entre a membrana basal e as células musculares é rompida, levando ao aparecimento da doença⁶. Pacientes com LAMA2-CMD apresentam um fenótipo leve a grave, dependendo do tipo de mutação no gene LAMA2.

Quando a função da proteína α2 da laminina é afetada, os pacientes podem experimentar hipotonia muscular grave ao nascimento e desenvolver inflamação crônica, fibrose e atrofia muscular, levando a uma redução da expectativa de vida. Até o momento, nenhum tratamento direcionado foi desenvolvido e as abordagens terapêuticas limitam-se a aliviar os sintomas da doença⁷. Portanto, a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes envolvidos no aparecimento dessa doença é crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas^{apropriadas6,8}. Trabalhos anteriores utilizando o camundongo dy^{W 9}, modelo para LAMA2-CMD, sugerem que o início da doença inicia-se no útero, especificamente durante a miogênese fetal¹⁰. Uma melhor compreensão de como o defeito da miogênese fetal emerge seria um divisor de águas na geração de novas abordagens terapêuticas para LAMA2-CMD.

Sistemas in vitro fornecem um ambiente controlado para o estudo de interações célula-célula e célula-MEC, mas os modelos de cultura 2D carecem da complexidade dos tecidos nativos. A descelularização dos tecidos produz arcabouços acelulares de MEC específicos para o estágio de desenvolvimento e tecido que mimetizam com mais precisão o microambiente celular natural em comparação com modelos 2D e arcabouços artificiais/sintéticos. As matrizes decelularizadas (dECMs) têm o potencial de preservar as pistas moleculares e mecânicas do tecido hospedeiro, tornando-as melhores modelos alternativos para o entendimento de processos in ^vivo11.

Existem várias técnicas, reagentes e condições que podem ser utilizadas para a descelularização^12,13. Neste estudo, um protocolo de descelularização para o coração fetal de camundongos, descrito por Silva et al.14,15, é adaptado ao músculo esquelético fetal de camundongos e retém todos os componentes da MEC testados (laminina α2, lamininas totais, fibronectina^, colágeno I e colágeno IV). O protocolo inclui três etapas: lise celular por choque osmótico (tampão hipotônico), dissolução da membrana plasmática e dissociação proteica (dodecil sulfato de sódio a 0,05% [SDS]) e destruição enzimática do DNA (tratamento com DNase). Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo estabelecido para a descelularização do músculo esquelético fetal de camundongos.

Para utilizar este sistema 3D in vitro para o estudo do LAMA2-CMD, é crucial manter a cadeia α2 da laminina após a decelularização. Portanto, um protocolo de otimização foi implementado onde diferentes detergentes (SDS e Triton X-100) e concentrações (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,5%) foram testados (dados não mostrados). A escolha ideal para remoção celular e preservação da proteína α2 da laminina foi SDS a 0,05%. Células C2C12, uma linhagem bem estabelecida de células mioblásticas^16,17, foram usadas para semear as dECMs. Essas células invadem a dMEC, proliferam e se diferenciam no interior desses arcabouços, sintetizando novas proteínas da MEC. A produção bem-sucedida deste modelo in vitro 3D oferece uma nova abordagem para a compreensão dos processos moleculares e celulares envolvidos na miogênese fetal, no início da LAMA2-CMD, e pode ser estendida a outras doenças musculares onde a comunicação entre a MEC e as células musculares esqueléticas é interrompida.