在这里,我们提出了一种基于内源性荧光标记的优化截面相关光电子显微镜的方案,作为研究稀有蛋白质与细胞超微结构相关的定位的工具。这种方法的力量通过内源性LC3在饥饿细胞中的超微结构定位而得到证明,而没有巴弗洛霉素处理。
通过电子显微镜 (EM) 在超微结构水平上可视化自噬细胞器对于确定其身份和揭示对理解自噬过程很重要的细节至关重要。然而,电镜方法通常缺乏分子信息,阻碍了电镜获得的超微结构信息与基于荧光显微镜的特定自噬蛋白定位的相关性。此外,在未改变的细胞条件下,自噬体的稀有性阻碍了电镜的研究,这需要高放大倍率,因此提供了有限的视野。
为了应对这两个挑战,应用了一种基于荧光标记的截面相关光电子显微镜 (CLEM) 方法将常见的自噬体标记物 LC3 与 EM 超微结构相关联。该方法用于在荧光显微镜下快速筛选细胞,结合其他相关标记物进行LC3标记。随后,通过CLEM鉴定选定的LC3标记斑点的潜在超微结构特征。该方法应用于饥饿的细胞,而不添加溶酶体酸化抑制剂。
在这些条件下,LC3 主要存在于自噬体上,很少存在于自溶酶体中,其中 LC3 迅速降解。这些数据显示了这种方法的可行性和敏感性,表明CLEM可用于在天然条件下提供LC3介导的自噬的超微结构见解,而无需药物治疗或遗传改变。总体而言,该方法通过将光学显微镜与EM数据桥接起来,为自噬蛋白和其他稀缺抗原的超微结构定位研究提供了有价值的工具。
自噬是细胞质蛋白和细胞器清除和再循环的关键过程。大自噬(以下简称自噬)的过程涉及双膜细胞器、自噬体的形成,它允许细胞包围细胞质分子和细胞器以进行溶酶体降解。在大多数细胞中,自噬发生在基础水平,并响应细胞条件(如饥饿或细胞应激)而上调。自噬要么以底物特异性方式发生,靶向特定结构或蛋白质进行降解,要么作为包含部分胞质溶胶的非选择性本体过程发生。在选择性自噬中,自噬体是通过将 Atg8 家族蛋白(微管相关蛋白 1A/B 轻链 3A/B/C [LC3] 和 GABARAP)与来自回收内体、高尔基体和/或内质网 (ER) 的膜结合而形成的1。LC3 直接或 通过 选择性自噬接头(如 P62/SQSTM)识别胞质溶胶中的自噬货物。然后,新的自噬膜可以与LC3结合,膨胀并融合,形成一个完整的双膜,包裹货物,称为自噬体。自噬体成熟并最终与内体或溶酶体融合,此后自噬货物和接头被降解2.
关于自噬体形成、成熟和融合的研究通常利用光学显微镜技术。LC3的荧光显微镜通常用于评估不同条件下自噬体的数量和细胞定位。此外,通过在所谓的串联探针中将 LC3 偶联到 pH 敏感的 GFP 和 pH 稳定的 RFP,可以测量活细胞中自噬的总通量作为 GFP 荧光损失的函数3。这些方法是研究人员了解不同条件下自噬的作用和机制的宝贵工具。另一个宝贵的工具是电子显微镜 (EM),它揭示了自噬细胞器在自噬不同阶段的超微结构 4,5,6,7,8。迄今为止,EM 仍然是通过形态区分不同的自噬膜来识别自噬体形成的精确阶段的首选方法:吞噬体(双膜未完全闭合)、自噬体(胞质货物周围的闭合双膜)和自噬酶体([部分] 自噬膜丢失)。然而,没有分子信息的形态学容易出现错误识别或歧义。免疫电镜是同时对自噬细胞器进行分子表征和形态学分类的最全面方法。例如,在解冻的冷冻切片上对 LC3 进行免疫金标记,可以对 LC3 进行超微结构定位,并精确鉴定 LC3 标记的细胞器9。
EM 的一个缺点是视野小,需要高放大倍率来观察自噬膜的精细超微结构,并且在免疫 EM 的情况下,需要定位标记目标蛋白质的标记。由于它们的稀缺性和低蛋白质水平,这通常会阻碍自噬体的定量 EM 分析。为了增加自噬体的数量,细胞通常被饿死并用巴弗洛霉素A1(BafA1)处理,BafA1是一种溶酶体酸化和降解的抑制剂。如果没有 BafA1 处理,由于这些细胞器的稀缺性,通过 EM 寻找自噬体是耗时的。本文中介绍的方法通过荧光标记和在荧光显微镜中解冻的冷冻切片上对内源性LC3进行成像来解决这个问题,然后再进一步准备EM。然后,荧光图像引导在EM中寻找LC3标记的结构。采集后,将EM图像与荧光图像相关联,以将分子信息(LC3的存在)添加到细胞的超微结构中。这种“截面CLEM”方法大大提高了发现LC3标记结构的能力,特别是在未经处理的条件下,以便随后通过EM进行鉴定和分类。
该方法应用于饥饿的肝母细胞瘤衍生的HEPG210 细胞,以在未改变(即未使用BafA1)条件下寻找自噬体。发现的荧光点相对较少(在 90 nm 切片中每个细胞图谱少于一个),这与 LC311 的高周转率一致。LC3-puncta 的这种稀疏性强调了 CLEM 的价值;通过选择具有多个荧光点的区域在电镜中成像,以比传统免疫电镜更有效的方式发现和表征LC3阳性细胞器。这表明,大多数 LC3 阳性细胞器是自噬体,由它们的形态定义,这与在 BafA1 处理的细胞中获得的结果形成鲜明对比,其中自溶酶体更常见9。这些数据表明,使用截面CLEM,可以在超微结构水平上研究自噬,而无需抑制自噬流动。
本文介绍的方法利用了基于冷冻切片的切片 CLEM 的最新进展 – IF 标记的高灵敏度以及 FM 和 EM 14,24 之间的准确(<100 nm 误差)相关性。这导致了一种方法对荧光标记稀缺的内源性蛋白质具有灵敏度,并且能够将其高精度地覆盖到 EM 超微结构上。因此,该方法避免了外源性标记蛋白的(过度)表达和使用灵敏度较低的EM标记的需要。CLEM在饥饿细胞中内源性LC3上的实例显示了该方法的可行性,而无需使用溶酶体抑制剂。
使用 Tokuyasu 方法获得的解冻冷冻切片是免疫电镜的理想样品,因为与树脂切片不同,它们对抗体具有渗透性。结合温和的固定和对比程序,这通常比其他方法产生卓越的标记效率,而不会影响详细的超微结构,并且出色地可视化细胞膜 12,25,26。此外,冷冻切片与荧光显微镜高度兼容,这使其成为CLEM的宝贵底物。经典的免疫金标记和冷冻切片上的CLEM都为理解亚细胞组织提供了开创性的见解14,27,28,29,30。
目前,由于不断发展和优化 14,20,24,31,32,33,34 提高了该方法的质量、适用性和准确性,CLEM 在解冻冷冻切片上的应用正变得越来越普遍。现在,通过对大型IF和EM图像图块集进行精确关联,该技术有助于筛选荧光标记的内源性细胞成分的超微结构14,32,33。与传统的免疫电镜相比,这是一个优势,在传统的免疫电镜中,寻找金标记结构通常需要高放大倍率,因此更加费力和耗时。正是由于这个原因,LC3 对超微结构的定位极大地受益于 CLEM。LC3阳性细胞器常见于自噬清除受阻时(即,当细胞用BafA1或pH升值剂处理时),而自噬细胞器在未改变或饥饿的细胞中迅速清除,导致非常低的稳态水平。在这种情况下,使用经典免疫电镜寻找LC3标记的细胞器可能具有挑战性,而CLEM具有明显的优势。
以前,树脂切片上的CLEM应用于使用LC3-GFP异位表达或LC3-GFP-RFP串联探针35,36,37,38,39的研究。在这些研究中,荧光成像在包埋之前或直接在丙烯酸树脂部分40中进行,随后通过EM筛选样品。树脂包埋有几个优点;自噬体超微结构通常保存完好,特别是如果材料是高压冷冻的 40.此外,重金属染色树脂包埋材料的对比度通常比铀基染色的冷冻切片更明显。树脂包埋切片与容积电镜方法兼容,例如阵列断层扫描、FIB-SEM 或连续块面 SEM,而冷冻切片则不兼容。在包埋前进行成像的方法中,活细胞成像是冷冻切片的 CLEM 中不可用的选项41。与这些替代方案相比,CLEM在冷冻切片上的主要优势是高IF信号,允许稀有蛋白质的免疫定位,而无需膜通透或过表达。这避免了潜在的膜提取、过表达伪影42 和受试者的基因修饰,再加上 IF 和 EM 中大面积相关的可能性,使其成为研究 LC3 和自噬的绝佳工具。
在这里,将切面 CLEM 应用于饥饿的 HEPG2 细胞表明,LC3 主要定位于被鉴定为自噬体的结构。此外,在自体溶酶体中发现了一些弱荧光斑点。这与用 BafA19 处理的细胞形成鲜明对比,反映了一旦自噬体与溶酶体融合,自噬体蛋白就会迅速降解。总体而言,数据表明,解冻冷冻切片的 CLEM 可以提供有关天然条件下 LC3 介导的自噬的见解。该数据还突出了该技术的灵敏度,因为即使在仅含有低水平完整LC3表位的自体溶酶体中也能检测到LC3。通过在不同模型和条件下对 LC3 进行成像来进一步应用该技术将提高我们对自噬和其他 LC3 介导的生物过程的理解,例如 LC3 相关的吞噬作用或 ATG8 与单膜的结合。
除自噬外,切面CLEM还可应用于其他罕见事件或结构,如细胞分裂、感染、组织中的罕见细胞类型、动粒、原代纤毛或细胞类型特异性细胞器。IF对感兴趣的受试者进行有效筛选可以极大地促进这些稀有物质的超微结构研究。此外,研究表明14 该技术可用于以比经典免疫电镜更灵敏的方式定位蛋白质。调整固定长度可以进一步扩展这种灵敏度,从而允许对丰度非常低或抗原性差的蛋白质进行超微结构定位。最后,切片CLEM方法简化了定量细胞器的快速选择,有助于对给定蛋白质的超微结构分布进行更稳健的分析。
冷冻切片的CLEM需要冷冻切片的设备和专业知识。在可以使用这些工具(例如冷冻切片机)的组中,剖面CLEM的实施非常简单,只需要使用自动宽视场显微镜即可使用,这是大多数实验室都可以使用的设置。此外,该方法在全球的EM设施中可用。由于截面CLEM结合了已建立的IF和EM方法的应用,因此该方法很容易适应,并且可以与例如断层扫描20,33,43,有限数量的切片44的连续切片体积EM或超分辨率显微镜45结合使用。该方法的这种多功能性支持应用于广泛的生物学问题。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢乌得勒支大学医学中心分子医学中心的同事们进行了富有成效的讨论和反馈。我们感谢Klumperman实验室过去和现在的同事,他们不断改进我们的显微镜技术。用于这项工作的 EM 基础设施是由荷兰研究委员会 (NWO) 资助的研究计划国家大规模研究基础设施路线图 (NEMI) 的一部分,项目编号为 184.034.014 到 JK。
Chemicals and reagents | |||
Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life Technologies | #A21202 | use 1:250 |
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life Technologies | A#10042 | use 1:250 |
Antibody mouse anti-LC3 | Cosmo Bio | CTB-LC3-2-IC | use 1:100 |
Antibody rabbit anti-LAMP1 | Cell Signaling | 9091 | use 1:250 |
Bovine serum Albumin, fraction V | Sigma-Aldrich | A-9647 | |
BSA-c | Aurion | 900.099 | |
BSA-conjugated gold | Cell Microscopy Core, UMC Utrecht | BSAG 5 nm | |
Water-free Chloroform | Merck | 1.02447.0500 | |
DAPI | Invitrogen | 10184322 | Use at end concentration of 10 µg/ml |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fish-skin Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Food-grade gelatin | Merck | G1890 | |
Formvar, Vinylec E | SPI | 02492-RA | |
Gluteraldehyde | Serva | 23115.01 | See CAUTION note |
Glycerol | Boom | MBAK 7044.1000 | |
Glycine | Merck | 1042010250 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Methylcellulose, 25 centipoises | Sigma-Aldrich | M-6385 | |
MgSO4 | Riedel-de Haen | 12142 | |
Na2HPO4 (PB component A) | Merck | 106580-0500 | |
NaBH4 | Merck | 806373 | |
NaH2PO4 (PB component B) | Merck | 106346 | |
NH4OH | Sigma-Aldrich | 221228-0025 | |
Oxalic acid | Merck | 100495 | |
Paraformaldehyde prills | Sigma-Aldrich | 441244 | See CAUTION note |
PIPES | Merck | 110220 | |
Protein-A conjugated gold | Cell Microscopy Core, UMC Utrecht | PAG 5, 10, 15 or 20 nm | |
Sucrose D(+) | VWR | 27483294 | |
Uranyl acetate | SPI | 020624-AB | See CAUTION note |
Tools and consumables | |||
Pick-up loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
Filter paper, qualitative, medium-fast | LLG | 6.242 668 | |
Finder grids | Ted Pella | G100F1 | |
Grids | Cell Microscopy Core, UMC Utrecht | CU 100 mesh | |
Microscopes | |||
Leica Thunder widefield microscope | Leica | Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software; | |
Leica UC7 ultracryomicrotome | Leica | ||
Tecnai T12 | FEI | Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software | |
Software | |||
ec-CLEM in icy | open source | Paul-Gilloteaux et al., 2017 | |
Fiji | open source | Schindelin et al., 2012 | |
IMOD | open source | Mastronarde et al., 2017 | |
Photoshop | Adobe | ||
SerialEM | open source | Mastronarde et al., 2018 |