Önerilen protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir.
Hücre dışı veziküller (EV’ler), in vitro ve in vivo hücreler tarafından salınan heterojen bir membran vezikülü popülasyonudur. Her yerde bulunmaları ve biyolojik bilgi taşıyıcıları olarak önemli rolleri, onları izolasyonları için güvenilir ve tekrarlayan protokoller gerektiren ilgi çekici çalışma nesneleri haline getirir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü araştırmalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır (uygun edinim gibi). Bu çalışma, küçük EV’lerin (MISEV 2018 terminolojisine göre) diferansiyel santrifüjlemeye dayalı tümör hücre hatlarının kültür süpernatantından izolasyonu için bir protokol sunmaktadır. Protokol, EV’lerin izolasyonu sırasında endotoksinlerle kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir. EV’lerin endotoksin kontaminasyonu, sonraki deneyleri önemli ölçüde engelleyebilir veya hatta gerçek biyolojik etkilerini maskeleyebilir. Öte yandan, gözden kaçan endotoksinlerin varlığı yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu, monositler de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücrelerine atıfta bulunurken özellikle önemlidir, çünkü monositler endotoksin kalıntılarına özellikle duyarlı bir popülasyon oluşturur. Bu nedenle, özellikle monositler, makrofajlar, miyeloid türevli baskılayıcı hücreler veya dendritik hücreler gibi endotoksine duyarlı hücrelerle çalışırken, EV’lerin endotoksin kontaminasyonu açısından taranması şiddetle tavsiye edilir.
MISEV 2018 terminolojisine göre hücre dışı veziküller (EV’ler), çok sayıda fizyolojik ve patolojik süreçte çok önemli rol oynayan hücre salgılanan membranöz veziküllerin çeşitli alt tiplerini tanımlayan kolektif bir terimdir 1,2. Dahası, EV’ler çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler, terapötik ajanlar ve ilaç dağıtım araçları olarak umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü satın almalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır3. Böyle bir zorluk, birçok durumda ihmal edilen endotoksin içermeyen EV’lerin izolasyonudur. En yaygın endotoksinlerden biri, gram-negatif bakteriyel hücre duvarlarının önemli bir bileşeni olan veçeşitli hücreler tarafından çok sayıda enflamatuar sitokinin salınması nedeniyle akut enflamatuar yanıta neden olabilen lipopolisakkarittir (LPS) 4,5. LPS, LPS bağlayıcı proteine bağlanarak bir yanıt indükler, ardından miyeloid hücreler üzerinde CD14 / TLR4 / MD2 kompleksi ile etkileşime girer. Bu etkileşim, MyD88 ve TRIF’e bağımlı sinyal yollarının aktivasyonuna yol açar ve bu da nükleer faktör kappa B’yi (NFkB) tetikler. NFkB’nin çekirdeğe translokasyonu, sitokinlerin üretimini başlatır6. Monositler ve makrofajlar LPS’ye karşı oldukça hassastır ve LPS’ye maruz kalmaları enflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin (örneğin, IL-6, IL-12, CXCL8 ve TNF-α) salınımına neden olur7,8. CD14 yapısı, benzer afiniteye sahip farklı LPS türlerinin bağlanmasını sağlar ve diğer toll-like reseptörleri (TLR’ler) için bir ko-reseptör görevi görür (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 ve 9)6. EV’lerin monositler / makrofajlar üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmaların sayısı halaartmaktadır 9,10,11. Özellikle monositlerin, alt popülasyonlarının ve diğer bağışıklık hücrelerinin fonksiyonlarını incelemek açısından bakıldığında, EV’lerde endotoksin varlığı ve hatta maskelenmiş varlığı büyük önem taşımaktadır12. EV’lerin endotoksinlerle göz ardı edilen kontaminasyonu, yanıltıcı sonuçlara yol açabilir ve gerçek biyolojik aktivitelerini gizleyebilir. Başka bir deyişle, monositik hücrelerle çalışmak, endotoksin kontaminasyonunun yokluğunda güven gerektirir13. Endotoksinlerin potansiyel kaynakları su, ticari olarak elde edilen ortam ve serumlar, ortam bileşenleri ve katkı maddeleri, laboratuvar cam eşyaları ve plastik eşyalar olabilir 5,14,15.
Bu nedenle, bu çalışma düşük endotoksin içeren EV’lerin izolasyonu için bir protokol geliştirmeyi amaçlamıştır. Protokol, endotoksinleri EV’lerden çıkarmak yerine, EV’lerin izolasyonu sırasında endotoksin kontaminasyonunun nasıl önleneceğine dair basit ipuçları sağlar. Daha önce, endotoksinlerin, örneğin nanotıpta kullanılan mühendislik nanopartiküllerinden nasıl çıkarılacağına dair birçok protokol sunulmuştu; ancak, hiçbiri EV’ler gibi biyolojik yapılar için yararlı değildir. Nanopartiküllerin etkili depirojenasyonu, etanol veya asetik asit durulama, 3 saat boyunca 175 ° C’de ısıtma, γ ışınlama veya triton X-100 muamelesi ile gerçekleştirilebilir; ancak, bu prosedürler EV’lerin 16,17’nin tahrip olmasına yol açmaktadır.
Sunulan protokol, EV’lerin monositler üzerindeki etkisi üzerine yapılan önceki çalışmaların aksine, EV’lerde endotoksin safsızlıklarından kaçınmaya odaklanan öncü bir çalışmadır9. Önerilen ilkelerin laboratuvar uygulamalarına uygulanması, EV’lerin klinikte terapötik ajanlar olarak potansiyel kullanımı göz önüne alındığında çok önemli olabilecek güvenilir araştırma sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olabilir12.
Son birkaç yılda, uygun EV’lerin izolasyonu için yöntemler giderek daha önemli hale geldi ve örneğin güvenilir omikler ve fonksiyonel veriler elde etme bağlamında daha güvenilir analizleri mümkün kıldı24. Önceki araştırma deneyimlerine dayanarak, sadece izolasyon yönteminin türünün değil, aynı zamanda bu prosedür sırasındaki diğer koşulların da önemli olabileceği görülmektedir. EV tükenmiş FBS’nin kullanımı yaygın olarak bir gereklilik olarak kabul edilmekted…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Polonya Ulusal Bilim Merkezi, 2019/33/B/NZ5/00647 hibe numarası ile desteklenmiştir. Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü’nden Profesör Tomasz Gosiewski ve Agnieszka Krawczyk’e EV’lerde bakteri DNA’sının tespitinde paha biçilmez yardımları için teşekkür ederiz.
Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |