Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

1. STEM 설정 예비 정렬: 컬럼 정렬 파일을 로드한 다음 컬럼 밸브를 엽니다. 측면 입구 크라이오 홀더를 사용하는 경우 크라이오 쉴드를 엽니다. TEM 모드에서 시작합니다. 빔이 화면에 나타나야 합니다. 그렇지 않은 경우 배율을 낮추십시오. 제어판의 버튼을 눌러 현미경을 유센트릭 초점으로 가져옵니다. 스폿 크기를 편리한 값(예: 6)으로 설정하여 직접 또는 내장 카메라(현미경 모델에 따라 다름)를 사용하여 형광 화면을 시각화합니다. 현미경을 STEM 모드로 설정하고 초점이 대물렌즈가 아닌 콘덴서 렌즈(강도)를 사용하는지 확인합니다. 유센트릭 포커스를 설정합니다. 그런 다음 초기 조정을 위해 회절 모드를 종료합니다. 빔이 비어 있지 않은지 확인하십시오. 빔이 화면에 나타날 때까지 배율을 줄입니다. 빔 이동을 중앙으로 조정하고 빔을 중앙에 유지하면서 최대 약 70kx까지 배율을 높입니다. 원하는 콘덴서 조리개(일반적으로 50μm)를 삽입합니다. 조리개 센터링을 확인하십시오. 초점 노브를 앞뒤로 약간 돌리면 스폿이 팽창 및 수축해야 하지만 비행기가 가상의 수직 모래시계를 자르는 것처럼 제자리에 남아 있어야 합니다. 조리개가 중앙에 있지 않으면 모래시계가 기울어진 것처럼 조명이 측면으로 이동합니다. 빔에 초점을 맞추고 정렬 탭에서 Intensity List Focus (사용 가능한 경우)를 누르거나 1.2에서와 같이 유센트릭 초점으로 돌아갑니다. 빔 위치를 중앙으로 재조정합니다. 회전 중심을 조정합니다. 초점 스텝 휠을 최소 또는 한 단계 위로 돌려 빔이 부드럽게 펄스되도록 하고 초점이 위아래로 움직일 때 고정된 상태를 유지하도록 합니다. 피벗 포인트를 선택하고 X 및 Y 조정과 함께 두 포인트를 가져옵니다.참고: 위상판이 TFS 계측기에 설치된 경우 X 조정만 사용해야 합니다. 빔의 초점을 약간 흐리게 하고 콘덴서 스티그메이터를 조정하여 디스크를 둥글게 만듭니다. 최적화를 위해 초점을 통해 위아래로 이동합니다. 초점을 통과할 때 한 방향 또는 다른 방향으로 늘어나는 경향이 없어야 합니다. 렌즈를 표준화합니다. 그런 다음 빔 시프트를 사용하여 스폿을 중앙에 유지하면서 배율을 약 240kx로 점진적으로 늘리고 회전 중심 및 피벗 포인트 조정을 반복합니다(1.6-1.8단계). 회절 모드로 돌아갑니다. 빔은 형광 스크린에 균일한 디스크로 나타나야 합니다. 카메라 길이(CL)는 이제 X선 결정학에서와 같이 검출기까지의 광학 거리를 효과적으로 제어합니다. 이를 변경하고 화면 위치가 표본 쪽으로 또는 표본에서 멀어지는 것처럼 디스크가 수축 및 확대되는 것을 관찰합니다. 이 원뿔은 BF 조명을 나타냅니다.참고: 각 CL에 대해 투사된 빔을 중심 축으로 가져오기 위해 조정해야 하는 회절 정렬이 있습니다. 일반적으로 모두 구체화할 필요는 없으며 탐지에 사용할 하나(또는 몇 개)만 구체화할 필요가 있습니다. 고배율에서 STEM 모드를 사용합니다.BF STEM 검출기를 사용할 수 있다면 그것으로 시작하십시오. 빈 구멍이 있는 영역으로 스테이지를 가져오고 원하는 CL을 사용하여 빔을 중앙에 배치하도록 회절 정렬을 조정합니다. 많은 현미경에는 HAADF 검출기만 장착되어 있습니다. 이것을 BF 감지기로 사용하는 트릭이 있습니다. 먼저 검출기를 집어넣고 위와 같이 빔을 직접 정렬하여 중앙에 배치하고 대물렌즈 조리개(일반적으로 20μm와 같은 작은 구멍)를 삽입하고 빔을 균일하게 둘러싸도록 위치를 조정합니다. (가장 쉬운 방법은 시편이나 테스트 그리드를 삽입하여 조명 주변의 후광을 확인하는 것입니다.) 그런 다음 회절 정렬을 사용하여 빔을 축에서 벗어나 검출기 영역으로 이동합니다. 빔이 검출기에 의해 차단되는지 확인하기 위해 화면의 빔을 보면서 검출기를 삽입하고 집어넣습니다. 현미경 소프트웨어에서 스캔을 시작하고 밝기 및 대비(B/C) 설정을 조정하여 빔이 가려지면 신호가 0에 가깝고 전체 조명이 검출기에 떨어질 때 포화에 가까워지도록 합니다. 스코프 디스플레이를 사용하여 지원하십시오. 설정이 예기치 않은 방식으로 결합될 수 있으므로 조정을 여러 번 반복해야 합니다. 현미경을 저배율(LM) 모드로 전환하지 않고 고배율 레지스터(SA 모드)에서 상대적으로 낮은 배율로 되돌립니다. 나중에 참조할 수 있도록 현재 화면을 기록해 두십시오(3.1.1단계 참조). 전류는 TEM에서와 같이 건 렌즈 및 스폿 크기 설정으로 변경할 수 있으며 감소된 전류에 해당하는 숫자가 증가합니다. 이 시점에서 FEG 레지스터를 저장하여 표준 값으로의 복귀를 용이하게 합니다.참고: 기능은 사용자가 작업 구성에서 시작할 수 있도록 기본 FEG 레지스터 세트를 준비할 수 있습니다. 2. 시편 배치 LM TEM 모드에서 그리드가 불투명하지 않은지 확인합니다. 초기 조정을 위한 그리드 사각형을 찾습니다. 빈 공간, 구멍 또는 찢어진 격자 사각형을 찾는 것이 편리합니다. 편리하게 돌아갈 수 있도록 무대 위치를 기록하십시오. 샘플을 유센트릭 높이로 가져옵니다. 이를 수행하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 예를 들어, 스테이지 워블러를 사용하여 그리드를 기울이면서 이미지가 측면 이동을 멈출 때까지 Z축을 따라 시편 높이를 이동합니다. 또는 viewing 화면에 일부 기능을 표시하고 s를 기울입니다.tage 30°로. 피쳐가 측면으로 이동합니다. 시편 높이를 조정하여 원래 위치로 되돌립니다. 확대 또는 스테이지 기울기를 높여 다듬습니다. 0° 기울기로 돌아갑니다. STEM 모드로 돌아가 STEM 검출기를 삽입합니다. 가장 낮은 고배율(SA) 모드로 이동합니다. 컴퓨터 화면에 이미지가 관찰되는지 확인합니다. 불필요한 노출을 피하기 위해 빠르게 스캔하십시오. 1μs/픽셀 이하가 일반적입니다. 스캔 속도가 너무 빠르면 왼쪽 테두리에서 이미지가 왜곡되어 나타날 수 있습니다( 그림 2 참조). Eucentric Focus를 누르고, 배율을 높이고, 스캔하는 동안 초점을 미세 조정합니다. 현미경 소프트웨어에서 제공하는 초점 확대경을 사용하는 것이 편리합니다. 콘덴서 난시를 조정하십시오. 이것은 Ronchigram 방법으로 가장 정확하게 수행 할 수 있습니다. 얇은 샘플 영역 위에 빔을 놓고 양쪽에 있는 샘플의 그림자 이미지 사이에서 투과된 빔이 폭발하는 지점에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 콘덴서 튜닝을 조정하여 중앙 디스크를 둥글게 만듭니다. 이를 위해서는 특히 극저온 샘플의 경우 약간의 연습이 필요합니다.참고: 대안은 일부 금 입자(종종 단층 촬영에서 정렬을 위한 기준 마커로 사용됨)를 찾는 것입니다. 배율을 높이고 위아래로 초점을 맞추고 난시를 조정하여 입자가 어느 방향으로든 늘어나지 않고 둥글게 유지되도록 합니다. LM STEM 모드로 이동하여 스캔을 계속하여 관심 있는 영역을 찾습니다. 필요한 경우 대략적으로 이 시점에서 감지기 B/C 설정을 다시 조정합니다(1.13.3단계). 3. 이미지 녹화 녹음을 위한 선량을 추정합니다. 일반적으로 전체 단층 촬영에 대해 100-150 e-/Å2 를 목표로 합니다. 검체당 선량 허용 오차를 확인하십시오. 암페어(A)의 전류를 전자당 전하로 나눈 값은 e-/s의 수를 나타내며, 여기에 노출 시간 T(초)를 곱하고 Å2의 시야로 나눕니다. 편의를 위해 전류를 나노암페어 단위(화면에서 읽은 대로), 시야 너비(마이크로미터), 프레임 노출 시간(초)을 적절한 요소로 표현합니다.이 숫자에 기울기 수를 곱하여 시리즈의 총 노출을 얻어야 합니다. 예를 들어, 전류 I = 0.04 nA, 필드 L = 4 μm, 노출 시간 12 초, 틸트 당 1.9 e / Å 2 또는 일련의 61 개 투영에 대해 약 110 e / Å2를 얻습니다. 스테이지를 구멍으로 되돌리고(또는 그리드를 후퇴) 스폿 크기 및/또는 건 렌즈 설정을 사용하여 빔 전류를 조정하여 원하는 화면 전류에 도달합니다. 측정값이 0이면 더 큰 C2 조리개를 삽입하여 전류를 증가시킵니다. 그런 다음 측정값을 직경 비율의 제곱으로 나누어 수정하고 마지막으로 더 작은 조리개로 돌아갑니다. 1.13.3 단계에 따라 B/C 설정을 수정하고 마지막으로 스테이지를 관심 영역으로 되돌리고 이미징 조건에서 직접 정렬 및 난시를 다시 확인합니다. 테스트 이미지를 획득합니다. 4. SerialEM을 이용한 단층 촬영 현미경 컴퓨터에서 SerialEM 서버를 시작합니다(SerialEM은 일반적으로 다른 서버에 설치됨). 그런 다음 SerialEM을 엽니다. STEM은 동일한 인터페이스로 카메라처럼 SerialEM에 나타납니다. 통신이 설정에 맞게 적절하게 실행되고 있는지 확인합니다. 예를 들어, 현미경 탭에 올바른 배율이 표시되어야 합니다. 그래도 문제가 해결되지 않으면 여기서 멈추고 문제를 해결하십시오. 카메라 및 스크립트 탭을 찾아 설정을 엽니다. STEM 카메라가 선택되어 있는지 확인하고 각 모드에 대해 적절한 비닝 및 체류 시간을 선택합니다. 적절한 감지기(또는 감지기)가 왼쪽 하단의 “획득할 채널” 상자에 나타나는지 확인합니다. 아래쪽에 있는 Acquire 를 눌러 테스트합니다. 다시 말하지만, 아무 일도 일어나지 않거나 빔이 비워지지 않으면 계속하지 마십시오. 통신을 중지하고 확인합니다.참고: 모드는 TEM 단층 촬영과 유사한 방식으로 사용됩니다. 비닝은 TEM과의 호환성을 위한 기교입니다. 중요한 매개변수는 픽셀 수입니다. 서로 다른 현미경 시스템은 동일한 개수에 도달하기 위해 서로 다른 비닝을 사용합니다.보기 및 검색은 비교적 적은 픽셀(예: 1초에서 512 x 512픽셀)로 빠르게 스캔해야 합니다. 초점은 일반적으로 빠른 기록이 있는 작은 영역입니다. 따라서 저선량 모드에서는 초점을 선택하여 기록 모드와 다른 배율로 설정하면 정확도에 도움이 될 수 있습니다. 스폿 크기는 변경하지 않고 그대로 둡니다. Record mode(녹화 모드)의 경우 노출 추정에서 위에서 선택한 파라미터를 사용합니다. 사용 가능한 경우 기울어진 이미지에서 초점을 한 줄씩 보정하는 Dynamic Focus도 선택합니다. 나중에 편의를 위해 미리 보기에 대한 범주닝을 보기에 대한 범주닝과 동일하게 선택합니다(개선 사항 #1, 5.5단계 참조). 이미지 크기(픽셀 수)가 같을 필요는 없습니다. 평가판 모드를 사용하여 획득하는 동안 레코드 영역을 중앙에 유지합니다. 보기와 비슷할 수 있지만 프레임 왼쪽에 스캔 왜곡이 나타나지 않도록 주의해야 합니다(예를 들어 그림 2 참조). 다시 말하지만, 저용량 모드에서 시험은 기록 모드와 다른 배율을 가질 수 있습니다. 그리드 스캔을 위해 몽타주 모드를 즉시 사용하십시오. 관심 영역을 찾을 수 있을 만큼 픽셀 밀도가 높아야 합니다. 권장 사항: 512 x 512 또는 1024 x 1024. 이 모드는 표본 영역을 찾는 데 사용되므로 적절한 다이내믹 레인지(이미지 디스플레이 컨트롤에서 볼 수 있음)로 이미지가 양호한지 확인하십시오. 이러한 선택 사항이 다음 세션(프로그램이 충돌하는 경우 곧 발생할 수 있음)에 대해 기본값으로 유지되도록 설정 파일을 저장합니다. 이미지 시프트 및 스테이지 시프트 보정을 테스트합니다. 마이크로프로브(또는 나노프로브) 모드에서 View Image(이미지 보기)를 클릭하고 마우스로 마우스를 가져간 다음 버튼을 누른 상태에서 대각선으로 약 1/4 정도 끕니다. 그런 다음 다른 보기를 가져옵니다. 이미지가 완벽하게 겹쳐야 합니다. Shift 키를 누른 상태에서 다시 드래그하여 반복합니다(스테이지 이동을 적용하기 위해). 이미지는 잘 겹쳐야 하지만 정확하지는 않을 수 있습니다. LM 모드로 이동하여 스테이지 이동을 테스트합니다. 이러한 테스트가 실패하면 중지하고 문제를 해결하십시오. 나머지는 작동하지 않습니다. 전체 그리드의 몽타주 LM 맵을 만듭니다. 이것은 TEM에서도 수행할 수 있습니다.이미지가 조리개(일반적으로 약 185x)에 의해 차단되지 않는 최저 배율 STEM 모드로 이동합니다. 네비게이터(Navigator) 메뉴를 클릭하고 열기(Open> 클릭합니다. 그런 다음 내비게이터(Navigator) 메뉴 > 내비게이션 옵션(Nav. Options)을 클릭하고 맵을 바이트로 변환(Convert Maps to Bytes)> 선택 해제합니다. 내비게이터(Navigator) 메뉴 > Montaging & Grids(몽타주 및 격자) > 전체 몽타주 설정(Setup Full Montage)을 선택합니다. 메뉴가 열립니다. 확인할 옵션은 이미지를 이동하는 대신 스테이지 이동, 내비게이터가 열려 있는 경우 각 몽타주에서 맵 만들기, 파라미터 기록이 아닌 몽타주 매핑 사용입니다. 이미지 그리드는 대략 6 x 6 또는 7 x 7이어야 합니다. 기록할 전체 영역을 찾습니다. 너무 많은 이미지가 필요한 경우 현미경에서 배율을 올바르게 판독하지 못할 수 있습니다(그림 3). 중지하고 확인하십시오. 몽타주 획득을 시작하려면 몽타주 컨트롤에서 시작을 누르거나 카메라 및 스크립트에서 몽타주를 누릅니다. 파일 매개 변수 : mrc, 정수로 저장, 또 다른 대화 상자에서 저장할 파일 이름을 선택하는 또 다른 메뉴가 열립니다. SerialEM의 자체 사용자 설정이 아닌 적절한 데이터 영역에 데이터를 저장해야 합니다. 시스템이 상주하는 C 디스크에 대용량 데이터를 저장하지 않는 것이 좋습니다. 수집이 완료되면 몽타주가 기본 창에 나타납니다(그림 4). 이제 TEM에서와 같이 네비게이터의 마커와 포인트를 사용하여 그리드를 탐색할 수 있습니다. 난시 교정을 다시 확인하십시오. 일반적으로 작은 영역을 빠르게 스캔하고 초점과 함께 조정하여 금 나노 입자와 같은 점과 같은 특징이 고배율에서 초점 안팎으로 통과 할 때 완전히 둥글게 유지되도록하는 것으로 충분합니다 (SEM에서와 같이). 보다 보수적으로 난시를 고치기 전에 1.5-1.8 단계의 직접 정렬을 반복 할 수 있습니다. 고배율 이미징을 LM 몽타주에 맞춥니다.쉽게 알아볼 수 있는 기능이 있는 LM 몽타주의 위치로 이동합니다. 포인트를 추가하고 네비게이터 창 > 포인트 추가를 클릭한 다음 피처를 클릭합니다. 비활성화하려면 다시 누르세요(추가 중지). 가장 낮은 고배율(HM) 배율로 View 또는 Trial 이미지를 촬영하고 표시된 항목을 찾습니다. 그림 5와 같이 마커를 배치하고(녹색 십자 표시) 네비게이터 창에서 해당 점을 강조 표시한 상태에서 네비게이터 메뉴에서 마커로 이동…> Shift 키를 누른 채 열리는 대화 상자에서 모든 맵과 Shift 저장을 선택합니다. 스테이지를 다른 위치로 이동하고 HM 이미지가 LM 몽타주에서 선택한 동일한 위치의 중앙에 있는지 확인하여 테스트합니다. HM 이미지에 피쳐가 표시되지 않으면 LM 모드와 HM 모드 간의 전환이 너무 클 수 있습니다. 이 경우 더 넓은 영역에 다각형 몽타주를 만듭니다. 탐색기 창 > 다각형 추가를 클릭하고 몇 가지 점을 선택한 다음 다각형 추가를 다시 클릭하여 닫습니다. 내비게이터(Navigator) >메뉴를 클릭하여 몽타주 및 격자(Montaging and Grids) > 폴리곤 몽타주 설정(Setup Polygon Montage)을 클릭하고 시작(Start)> 몽타주 컨트롤(Montage Controls)을 클릭합니다. 그런 다음 위와 같이 해당 지점을 찾아 Shift to Marker…. 저용량 모드를 설정합니다.Low Dose Control(저 용량 제어 ) 탭을 열고 Low Dose Mode(저용량 모드 ) 상자를 선택합니다. 연속 업데이트를 선택하고 보기로 이동합니다. 이 모드에 대한 현미경 배율(일반적으로 가장 낮거나 가장 낮은 배율)을 선택합니다. 다음 모드를 각각 선택하고 적절한 배율을 설정합니다. 원하는 픽셀 크기를 달성하도록 녹화를 설정해야 하며, 초점 배율은 초점을 맞추기 위한 기준 마커 또는 기타 고대비 기능이 명확하게 해결될 만큼 충분히 높아야 합니다. 그런 다음 즉시 연속 업데이트의 선택을 취소합니다.알림: 평가판 모드는 녹화와 유사하게 설정할 수 있으며, 이 경우 노출을 최소화하기 위해 추적 영역을 녹화 영역에서 이동하거나 주변의 대부분을 포함하는 낮은 배율로 이동해야 합니다. 뷰 이미지를 촬영하고 영역 위치 정의: 시도를 사용하여 시행 위치를 설정합니다.참고: 권장 사항 #1: 샘플링된 영역과 시간의 변화를 감안할 때 저mag 시험에 대한 추가 노출은 최소화될 수 있습니다. 그리드 막대가 시야에 들어가지 않는 한, 이 추적 방법은 일반적으로 더 안정적입니다. 권장 사항 #2: 초점과 같은 다양한 모드에 대한 선량을 조정하기 위해 스팟 크기를 업데이트할 수도 있습니다. 현미경 광학 설정의 안정성을 위해 이렇게 하지 말고 스폿 크기를 기록에 적합한 상태로 두고 더 빠른 스캔 모드를 위해 필요한 경우 노출 시간을 조정하는 것이 좋습니다. Low Dose Control(저선량 조절) >탭을 클릭하고 Rec.(녹화)로 이동한 다음 Navigator(네비게이터) 메뉴를 클릭하고 Open Imaging States(이미징 상태 열기> 현재 상태 추가(Add Current State)> 클릭합니다. 쉽게 불러올 수 있도록 이름을 지정합니다(예: 마이크로프로브 STEM의 경우 μP STEM). 서로 다른 작업에 대해 다양한 상태를 정의할 수 있습니다. 스테이지를 단층 촬영을 위해 관심 위치로 이동합니다(내비게이터 사용에 대한 자세한 내용은 아래 참조).네비게이터(Navigator) 창을 클릭하고 포인트 추가(Add Points)를 클릭하여 네비게이터에 포인트를 추가합니다>. 작업(Tasks) > 유중심도(Eucentricity) > 거칠기(Rough)를 선택하여 유센트릭 높이를 미세 조정합니다. 탐색기 창 > Z 업데이트. 집중 및 시도 영역을 설정합니다. 먼저 뷰 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 Low Dose Control(저용량 제어 ) 탭의 Define position of area(영역 위치 정의)에서 Focus(초점) 또는 Trial(시도)을 선택합니다. 기울기 축을 따라 두 영역의 위치를 조정합니다. 초점이 녹화 영역과 겹치지 않아야 합니다.알림: 특히 왼쪽 가장자리에 약간의 오버슈트가 있으므로 둘 다 레코드 영역 바로 옆에 설정해서는 안 됩니다. 오버슛의 정도는 기록 배율에서 반복적으로 스캔한 다음 배율을 줄여 더 넓은 시야를 확보하여 테스트 영역에서 평가할 수 있습니다. 좋은 측정을 위해(경험에 따라 선택 사항) 스테이지를 +60°로 기울인 다음 -60°로 기울입니다. View 또는 Preview 이미지를 촬영할 때마다 그리드 막대가 녹색으로 표시된 레코드 영역 필드 필드에 들어가지 않도록 합니다. 틸트 시리즈를 설정합니다.파일 > 새로 열기 를 클릭하여 데이터를 저장할 새 파일을 열고 파일 이름을 선택합니다. Tilt Series 설정(Tilt Series Setup)> Tilt Series 메뉴를 선택합니다(그림 6). 문제 해결: 새로 열기 버튼이 회색이면 이전 틸트 시리즈가 종료되었는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 Tilt Series > Terminate를 클릭하여 종료합니다. 기울기 및 끝 상자에서 극단적인 기울기 각도(일반적으로 각각 -60° 및 +60°)와 증분(일반적으로 2°)을 설정합니다. 선량 대칭 모드(권장 – 저선량 모드가 여전히 활성화되어 있는지 확인)의 경우 ___에서 두 방향으로 시리즈 실행을 선택합니다. 블랭크는 일반적으로 0이지만 미리 기울어 진 FIB 라멜라 (예 : 20 °)를 보상하는 데 사용할 수 있습니다. 단순화를 위해 노출 시간을 일정하게 유지를 선택합니다. 이를 변경하려면 노출 계산을 일부 재작업해야 하며 예상 강도를 원본 데이터와 비교하는 대수적 재구성(예: ART/SART/SIRT)을 방해할 수도 있습니다(7.1단계 참조). 자동 초점 건너뛰기를 선택합니다. 1mrad와 같은 작은 반수렴각은 초점을 맞출 필요가 없을 정도로 긴 피사계 심도를 의미합니다. 테스트로 0°에 초점을 맞추고 60° 또는 -60°로 기울인 다음 녹화를 누릅니다. 초점을 유지하는 것은 주로 정확한 유센트릭 높이의 문제입니다. 더 큰 수렴을 위해서는 시리즈 중에 초점을 맞춰야 할 수도 있습니다. 이 경우 보기를 하고 Low Dose Control 탭에서 영역과 초점의 위치를 정의하고 초점 영역을 조정합니다. 초기 및 최종 조치: 유센트릭 높이 조정이 정확하게 수행되었다면 반복할 필요가 없습니다. 그렇게 하지 말아야 할 합당한 이유가 없는 한 Close column valves at end of series(시리즈 끝에서 컬럼 밸브 닫기 )를 선택 취소합니다. 제어 매개 변수를 추적하기 위해 많은 옵션이 있습니다. 무인 데이터 수집의 경우 최우선 순위는 사용자 입력을 위해 프로그램이 중지되지 않도록 하는 것입니다. 권장 설정 사용: 손실된 필드의 백분율이 5보다 큰 경우 기록을 반복합니다. 그런 다음 다음 트랙을 선택하고 새 트랙 참조를 가져오기 전에 미리 보기로 정렬 및 레코드 정렬이 2% 다른 경우 새 트랙 참조 가져오기 를 선택합니다. 유인 데이터 수집의 경우 기기 시간 손실 위험을 방지하기 위해 보다 엄격한 파라미터를 적용합니다. 시작할 준비가 되면 창 하단에 있는 GO 를 누릅니다. 마지막에 Tilt Series(틸트 시리즈) > Terminate(종료)를 선택합니다. 5. 네비게이터를 사용하여 여러 지점에서 일괄 획득 (개선 사항 # 1) 참고: 이 프로토콜은 a) TEM과 동일하고 b) 전체 설명을 쓸모 없게 만드는 새로운 도구를 사용할 수 있게 되었기 때문에 초보적입니다. 전체 그리드 몽타주를 주 창에 로드합니다. 유망해 보이는 여러 영역을 선택하십시오. 점 추가(Add Points )를 클릭하고 선택한 격자선 사각형의 중심에 추가합니다. 포인트 추가를 다시 클릭하여 모드를 비활성화합니다. 저선량 이미징 상태가 활성화된 상태에서 네비게이터 창(Navigator window)을 선택하고 선택한 각 사각형>에 대해 항목에서 획득(Acquire) 및 새 파일(New File at Item)을 선택합니다. 첫 번째로 파일 속성(그림 7)과 파일 이름에 대한 대화 상자가 열립니다. Montaged images(몽타주 이미지)를 선택한 다음 Montage Setup(몽타주 설정) 대화 상자(그림 8)에서 Use View parameters in Low Dose mode(저선량 모드에서 뷰 매개변수 사용)를 선택하고 정사각형(약 100 x 100μm)을 덮을 수 있을 만큼 큰 그리드를 만듭니다. Navigator 메뉴를 클릭하고 항목에서 획득> 매핑을 위한 매개변수를 선택합니다. 가장 중요한 것은 기본 작업에서 Make Navigator Map(네비게이터 맵 만들기)을 선택한 다음 Rough Eucentricity(대략적인 Eucentricity) 및 Fine Eucentricity(미세 유중심성)를 선택하고 Go(이동)를 누르는 것입니다(그림 9). 200 메시 그리드의 경우 대략 전체 정사각형의 맵이 생성됩니다 (그림 10) 단층 촬영 위치 선택을 준비합니다. 파일 > 새로 열기를 클릭하여 새 파일을 엽니다. 파일 이름(예: AnchorMaps.mrc)을 지정합니다.Low Dose 모드가 활성화된 상태에서 Camera & Script > Setup 으로 들어가 View와 Preview가 동일한 비닝에 있는지 확인합니다(그렇지 않으면 동일한 파일에 저장할 수 없음). 네비게이터 창을 클릭하고 XYZ로 이동> 정사각형 맵의 포인트를 방문합니다. 마커가 있는 첫 번째 단층 촬영의 위치를 선택합니다. 미리보기 이미지를 찍고 마우스 오른쪽 버튼으로 드래그하여 위치를 구체화합니다. 그런 다음 새 맵> 네비게이터 창을 선택하고 대화 상자에서 예를 클릭하여 저장합니다. 그런 다음 동일한 지역의 뷰 이미지를 찍고 다시 새 지도로 저장합니다. View map이 강조 표시되어 있는지 확인하고 오른쪽 상단의 Navigator 창에서 For anchor state 를 선택합니다. 두 번째 위치를 선택하고 다시 미리보기를 수행하고 위와 같이 위치를 구체화한 다음 이번에는 네비게이터 창에서 앵커 맵을 누릅니다. 이렇게 하면 미리보기와 뷰가 모두 네비게이터에 새 맵으로 저장됩니다. 원하는 모든 위치에 대해 5.5.4단계를 반복합니다. 점을 선택하고 네비게이터 창에서 XYZ로 이동 을 눌러 한 그리드 사각형에서 다른 그리드 사각형으로 이동합니다. 참조 초점의 경우 격자의 명확한 영역을 선택하고 손으로 또는 자동 초점으로 조심스럽게 초점을 맞춥니다. 현미경 패널에서 Reset defocus 를 누릅니다. 스크립트 > 편집 > 편집 15 (또는 다른 무료 번호)를 클릭하고 ScriptName, SetDefocus 및 SetDefocus 0의 두 줄을 입력하여 SerialEM에서 스크립트를 만듭니다. 네비게이터 창에서 첫 번째 위치(미리보기 또는 보기)를 강조 표시합니다. Shift-T 를 누른 다음 마지막 위치를 강조 표시하고 Shift-T를 다시 누릅니다. 파일 속성 대화 상자가 열립니다. 파일 이름을 포함하여 저장할 단일 프레임 이미지와 매개 변수를 선택합니다. 파일 이름을 편집하되 항목 레이블은 끝에 그대로 둡니다.참고: 숫자로 끝나는 파일 이름은 연속적인 틸트 시리즈에 대해 자동으로 업데이트됩니다. 네비게이터(Navigator) 메뉴 > 내비게이션(Nav) 옵션을 사용하는 것이 편리합니다. 파일 이름에 항목 레이블 사용> 옵션입니다. 다음으로 Tilt Series Setup 메뉴가 자동으로 열립니다. 이전과 같이 채우기(그림 6)를 채우되 Refine eucentricity(eucentricity 미세 조정)를 선택하지 마십시오. 이제 네비게이터의 미리보기 포인트가 TS로 표시됩니다. 항목 목록 위에 있는 네비게이터 창의 버튼을 사용하여 이 메뉴로 돌아갈 수 있습니다. Navigator 메뉴 > Acquire at items를 선택합니다. 이번에는 최종 데이터에 대한 매개 변수를 선택합니다. 기본 작업 선택: 틸트 시리즈를 획득하고 듀어/진공 관리, 항목에 다시 정렬, 미세 유심도 및 작업 전 스크립트 실행을 선택하고 Script to run: SetDefocus를 선택합니다. 일반 옵션 선택: 오류 발생 시 메시지 상자 없음, 마지막에 컬럼 밸브를 닫은 다음 GO를 누르십시오(그림 11). 이제 SerialEM은 모든 앵커 맵을 방문하여 각 위치에서 틸트 시리즈를 기록합니다(그림 12). 6. CLEM 맵 등록 (Enhancement #2) 아직 완료하지 않은 경우 전체 그리드 몽타주를 주 창에 로드한 다음 창 > 새 창을 클릭하고 이름을 지정하여 새 창을 만듭니다. 전체 그리드 몽타주는 등록 1에 나타납니다. Import map의 Navigator 메뉴를 클릭하여 CLEM 맵 이미지를 가져옵니다> 등록 2에 들어가야 합니다. 위와 같이 새 창을 할당할 수도 있습니다. CLEM 맵을 검사하여 전체 그리드 몽타주에 대한 상대적 회전을 결정합니다. 그리드 막대가 나타나는 맵에서 이 작업을 수행하는 것이 가장 쉽습니다. 지도가 뒤집힐 수도 있습니다. Navigator 메뉴 > Rotate Map을 사용하여 대략적으로 정렬하고 필요한 경우 Flip을 사용합니다.참고: 다음 단계에서도 플립을 수용할 수 있지만 미리 수행하면 다음이 훨씬 쉬워집니다. 이 단계는 정렬이 만족스러워 보일 때까지 반복될 수 있지만 정확할 필요는 없습니다. 정확한 정렬을 위해 등록 포인트를 소개합니다. 한 창에 해당하는 여러 점을 배치한 다음 다른 창에 배치합니다. 이러한 각 지점에 대해 네비게이터 창의 맨 위에 있는 등록 지점을 선택합니다. 해당 포인트에는 오름차순 인덱스가 표시되고, 그리드 몽타주 또는 가져온 맵에 대해 각각 R1 또는 R2가 표시됩니다.알림: 파인더 그리드를 사용하면 이 단계가 매우 간단해집니다. 그렇지 않으면 중심 마커 또는 격자선 사각형의 모서리와 같은 솔리드 피쳐를 선택합니다. 원칙적으로 조잡한 정렬에는 3개의 점이면 충분하지만 더 많은 점이 몽타주 구성의 사소한 불일치를 보상하는 데 도움이 됩니다. CLEM 맵의 여러 채널이 필요한 경우(예: 다른 형광 색상 또는 명시야 배경이 없는 형광) 위의 6.2단계에서와 같이 해당 채널을 가져오고 등록을 2로 변경합니다. 이렇게 하면 첫 번째 맵에서 등록 포인트를 상속받게 됩니다. Transform items(항목 변환) 메뉴 > Navigator 메뉴로 등록을 적용합니다. 이제 해당 등록 지점이 모든 맵에 나타나며 등록 1에 나열됩니다. 시각적으로 정렬하려면 Navigator 메뉴 > Rotate Map을 클릭합니다. 네비게이터 창에서 맵을 로드할 때 로드 시 회전 상자를 선택하지 않으면 자동으로 회전되지 않습니다. 네비게이터 창에서 항상 회전할 수 있습니다. 이제 형광 맵에 마커 또는 점을 배치하고 스테이지를 그리드의 해당 위치로 이동할 수 있습니다(그림 13). 7.3D 재건 여기에는 TEM 단층 촬영과 동일한 기본 단계가 포함됩니다 : 틸트 시리즈의 정렬 후 일반적으로 백 프로젝션이 뒤 따릅니다. 몇몇 소프트웨어 플랫폼들이 이용가능하고, 데이터는 TEM 데이터와 유사하게 처리될 수 있지만, CTF 보정은 스킵되어야 한다. 강도 정규화를 적용하여 높은 기울기 투영의 기여도를 높이거나 시리즈 중 조명 변화의 균형을 맞추기 위해 정량적 정보가 영향을 받는다는 경고와 함께 적용합니다. 예를 들어, IMOD26 은 잘 작동하는 반면 AreTomo27 은 신탁이 없는 정렬에 매우 유용합니다. 기준 입자가 있는 경우 ClusterAlign28 은 개별 스폿이 아닌 클러스터로 입자를 따라갈 수 있습니다. 이는 고대비 기능에 의해 스팟이 손실되거나 숨겨질 수 있는 STEM 데이터에 특히 유용합니다. 콘트라스트 향상 및 노이즈 제거를 위해 3D 디콘볼루션29 로 재구성을 따르십시오. 재구성되면 orthoslices 또는 isosurface segmentation과 같은 표준 방법으로 STEM 부피 데이터를 나타냅니다. 특히, 강도 분포는 기존의 위상차 TEM에서 나타나는 대비 반전 또는 푸리에 프린지가 없는 단극입니다. 일반적으로 STEM 단층 촬영을 표현하는 흥미로운 방법은 명시야를 반전시키는 것입니다(그림 14). 그 효과는 “X선 눈”의 효과로, 정화된 셀(30)을 통해 조밀한 관심 물체를 볼 수 있다.