クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

1.ステムのセットアップ 予備アライメント: カラムアライメントファイルをロードし、 カラムバルブを開きます。サイドエントリークライオホルダーを使用する場合は、 クライオシールドを開きます。TEMモードで起動します。ビームが画面に表示されます。そうでない場合は、倍率を下げます。 コントロールパネルのボタンを押して、顕微鏡をユーセントリックフォーカスにします。 スポットサイズを、蛍光スクリーンを直接または内蔵カメラ(顕微鏡モデルに応じて)で視覚化するのに便利な値(例:6)に設定します。 顕微鏡をSTEMモードに設定し、フォーカスが対物レンズではなく集光レンズ(強度)を使用していることを確認します。ユーセントリックフォーカスを設定します。次に、初期調整のために回折モードを終了します。 ビームが空白になっていないことを確認してください。ビームが画面に表示されるまで倍率を下げます。ビームを中央にシフトし、ビームを中央に保ちながら、最大で約70kxのステップで倍率を上げます。 目的のコンデンサー開口部(通常は50μm)を挿入します。絞りのセンタリングを確認してください。フォーカスノブを少し前後に回すと、スポットは伸縮しますが、飛行機が想像上の垂直砂時計を切断するかのように、所定の位置にとどまります。絞りが中央にない場合、砂時計が傾いているかのように、照明は横方向にシフトします。 ビームに焦点を合わせ、位置合わせタブの 強度リスト フォーカス(使用可能な場合)を押すか、1.2のようにユーセントリックフォーカスに戻ります。ビーム位置を中央に再調整します。 回転の中心を調整します。フォーカスステップホイールを最小または1ステップ上に回して、ビームが穏やかにパルスするようにし、フォーカスが上下に移動してもビームが静止していることを確認します。 ピボットポイントを選択し、2つのポイントをXとYの調整でまとめます。注意: 位相プレートがTFS機器に取り付けられている場合は、X調整のみを使用する必要があります。 ビームの焦点を少し下げ、コンデンサースティグメーターを調整してディスクを丸くします。フォーカスを上下に移動して最適化します。フォーカスを通過するときに一方向または他の方向に伸びる傾向があってはなりません。 レンズを正規化します。次に、ビームシフトを使用してスポットを中央に保ちながら、倍率を約240kxまで徐々に上げ、回転中心とピボットポイントの調整を繰り返します(手順1.6〜1.8)。 回折モードに戻ります。ビームは蛍光スクリーン上に均一なディスクとして現れるはずです。カメラの長さ(CL)は、X線結晶構造解析のように、検出器までの光学距離を効果的に制御するようになりました。それを変更し、画面の位置が標本に近づいたり遠ざかったりするかのように、ディスクが収縮および拡大するのを確認します。この円錐はBFイルミネーションを表します。注:CLごとに、投影ビームを中心軸に合わせるために調整する回折アライメントがあります。通常、それらすべてを絞り込む必要はなく、検出に使用するのは1つ(または少数)だけです。 高倍率でSTEMモードを使用します。BF STEM検出器が利用可能な場合は、そこから始めます。空の穴のある領域にステージを移動し、回折アライメントを調整して、目的のCLを使用してビームを中央に配置します。 多くの顕微鏡にはHAADF検出器しか装備されていません。これをBF検出器として使用するトリックがあります。まず、検出器を後退させ、上記のようにビームを直接位置合わせの中心に配置し、対物レンズ開口部(通常は20μmなどの小さな開口部)を挿入し、ビームを均一に囲むように位置を調整します。(これを行う最も簡単な方法は、試験片またはテストグリッドを挿入して、照明の周りのハローを確認することです)。次に、回折アライメントを使用して、ビームを軸から外して検出器領域に移動します。画面上のビームを見ながら検出器を挿入および収縮させ、ビームが検出器によってブロックされていることを確認します。 顕微鏡ソフトウェアでスキャンを開始し、明るさとコントラスト(B/C)の設定を調整して、ビームがブランクされると信号が0に近く、検出器に完全な照明が当たると飽和に近くなるようにします。スコープ表示を使用して支援します。設定は予期しない方法で結合される可能性があるため、調整を数回繰り返す必要があります。 顕微鏡を低倍率(LM)モードに入らずに、高倍率レジスタ(SAモード)で比較的低い倍率に戻します。 後で参照できるように、画面の電流をメモします(手順3.1.1を参照)。電流は、TEMと同様に、ガンレンズとスポットサイズの設定で変更でき、電流の減少に対応する数値が増加します。 この時点で、FEGレジスタを保存して、標準値に戻しやすくします。注:施設は、ユーザーが作業構成から開始できるように、FEGレジスタのデフォルトセットを準備できます。 2. 試料の配置 LM TEM モードでは、グリッドが不透明でないことを確認します。初期調整を行うためのグリッドの正方形を見つけます。空の領域、穴、または破れたグリッドの正方形を見つけると便利です。ステージの位置を記録して、便利に戻します。 サンプルをユーセントリックの高さにします。これを行うにはいくつかの方法があります。例えば、ステージワブラーを使用して、画像が横方向にシフトしなくなるまで、Z軸に沿って標本の高さを移動しながらグリッドを傾けます。または、表示画面でいくつかの機能をマークし、ステージを30°傾けます。フィーチャが横方向に移動します。試験片の高さを調整して元の位置に戻します。倍率またはステージの傾きを上げて絞り込みます。0°の傾きに戻ります。 STEMモードに戻り、STEM検出器を挿入します。最低の高倍率(SA)モードに移動します。コンピュータ画面に画像が表示されることを確認します。不必要な露出を避けるために迅速にスキャンします。1μs/ピクセル以下が一般的です。スキャンが速すぎると、画像の左の境界線が歪んで表示される場合があることに注意してください( 図2を参照)。 ユーセントリックフォーカスを押し、倍率を上げて、スキャン中にフォーカスを調整します。顕微鏡ソフトウェアが提供するフォーカスルーペを使用すると便利です。 コンデンサーの乱視を調整します。これはロンキグラム法によって最も正確に行うことができます。薄いサンプル領域にビームを当てて、送信ビームが爆発するポイント、両側のサンプルのシャドウ画像の間に焦点を合わせます。次に、コンデンサーのチューニングを調整して、中央のディスクを丸くします。これには、特に極低温サンプルの場合、ある程度の練習が必要です。注:別の方法は、いくつかの金粒子を見つけることです(トモグラフィーでのアライメントの基準マーカーとしてよく使用されます)。倍率を上げて上下に焦点を合わせ、粒子がどちらの方向にも伸びずに丸いままになるように非点収差を調整します。 LM STEMモードに移動し、スキャンを続行して興味深い領域を見つけます。必要に応じて、おおよそこの時点で検出器のB / C設定を再調整します(手順1.13.3)。 3.画像を記録する 記録する線量を推定します。経験則として、断層像全体で100-150 e-/Å2 を目指します。検体ごとの線量耐性を確認してください。アンペア(A)単位の電流を電子あたりの電荷で割った値は、e-/sのカウントを表し、これに秒単位の露光時間 Tを掛け、Å2の視野で割ったものです。便宜上、電流をナノアンペア(画面から読み取ったもの)、視野の幅をマイクロメートルで、フレームの露光時間を秒単位で適切な係数で表します。この数値に傾斜数を掛けて、シリーズの合計露出を取得する必要があります。たとえば、電流I = 0.04 nA、磁場L = 4 μm、露光時間が12 sの場合、傾斜あたり1.9 e-/Å2、または一連の61の投影で約110 e-/Å2が得られます。 ステージを穴に戻し(またはグリッドを引っ込めて)、スポットサイズやガンレンズの設定を使用してビーム電流を調整し、目的のスクリーン電流に到達します。測定値が0の場合は、より大きなC2アパーチャを挿入して電流を増やします。次に、測定値を直径の比率の2乗で割って修正し、最後に小さい方の開口部に戻ります。 手順1.13.3に従ってB / C設定を調整し、最後にステージを関心のある領域に戻し、イメージング条件下での直接位置合わせと非点収差を再確認します。 テスト画像を取得します。 4. シリアルEMによるトモグラフィー 顕微鏡コンピュータでシリアルEMサーバーを起動します(シリアルEMは通常、別のコンピュータにインストールされます)。次に、 シリアルEMを開きます。STEMは、同じインターフェースを備えたカメラのようにシリアルEMに表示されます。通信がセットアップに対して適切に実行されていることを確認します。たとえば、[顕微鏡]タブには正しい倍率が表示されます。これが機能しない場合は、ここで停止してトラブルシューティングを行います。 カメラとスクリプトのタブを見つけて 、[セットアップ]を開きます。STEMカメラが選択されていることを確認し、モードごとに適切なビニング時間と滞留時間を選択します。適切な検出器が左下の[取得するチャネル]ボックスに表示されていることを確認します。下部にある [ 取得 ] を押してテストします。繰り返しますが、何も起こらない場合、またはビームが空白にならない場合は、続行しないでください。通信を停止して確認します。注:モードはTEM断層撮影と同様の方法で使用されます。ビニングはTEMとの互換性のための工夫です。重要なパラメータはピクセル数です。異なる顕微鏡システムは、同じカウントに到達するために異なるビニングを使用します。表示と検索は、比較的少ないピクセル(たとえば、1秒で512 x 512ピクセル)の高速スキャンである必要があります。 フォーカスは通常、高速記録の小さな領域です。したがって、低線量モードでは、フォーカスを選択して記録モードとは異なる倍率にし、精度を高めることができます。スポットサイズは変更しないでください。 記録モードでは、露出推定で上記で選択したパラメータを使用します。可能な場合は、ダイナミックフォーカスも選択して、傾いた画像の フォーカスを行ごとに補正します。 後で便宜上、プレビューのビニングをビューのビニングと同じに選択します(拡張機能#1、ステップ5.5を参照)。画像サイズ(ピクセル数)は同じである必要はありません。 試用モードを使用して、集録中にレコード領域を中央に保ちます。これは View と似ていますが、フレームの左側に明らかなスキャンの歪みがないように注意してください (例については 、図 2 を参照してください)。繰り返しになりますが、低線量モードでは、試験は記録モードとは異なる倍率を持つことができます。 グリッドスキャンには、すぐにモンタージュモードを使用します。関心のある領域を見つけるのに十分なピクセル密度である必要があります。推奨: 512 x 512 または 1024 x 1024。このモードは標本領域を見つけるために使用されるため、適切なダイナミックレンジ(画像表示コントロールに表示される)で画像が良好であることを確認してください。 設定ファイルを保存して、これらの選択肢が次のセッションのデフォルトとして保持されるようにします(プログラムがクラッシュした場合にすぐに発生する可能性があります)。 画像シフトとステージシフトのキャリブレーションをテストします。マイクロプローブ(またはナノプローブ)モードでは、[ 画像の表示]をクリックし、マウスでその上にカーソルを合わせ、ボタンを押したまま、視野の約4分の1だけ斜めにドラッグします。次に、別のビューを取得します。画像は完全に重なっている必要があります。 Shift キーを押したままもう一度ドラッグして繰り返します(ステージの移動を強制するため)。画像はうまく重なり合うはずですが、おそらく精度は低くなります。 LMモードに移動し、ステージシフトをテストします。これらのテストが失敗した場合は、停止してトラブルシューティングを行います。残りは機能しません。 グリッド全体のモンタージュLMマップを作成します。これはTEMでも行うことができます。画像が絞りで遮られない最低倍率のSTEMモード(通常は約185倍)に移動します。 「ナビゲーター」メニュー>「開く」をクリックします。次に、「ナビゲータ」メニュー>「ナビゲーションオプション」をクリックし>マップをバイトに変換を選択解除します。 [ナビゲーター] メニュー > [Montaging & Grids] > [Full Montage] を選択します。メニューが開きます。チェックするオプションは、画像をシフトする代わりにステージを移動する、ナビゲーターが開いている場合は各モンタージュからマップを作成する、およびレコードパラメーターではなくモンタージュマッピングを使用するです。画像グリッドは、約 6 x 6 または 7 x 7 である必要があります。記録する総面積を探します。必要な画像が多すぎると、顕微鏡から倍率が正しく読み取られない可能性があります(図3)。停止して確認してください。 モンタージュの取得を開始するには、モンタージュコントロールの[開始]を押すか、[カメラとスクリプト]の下の[モンタージュ]を押します。 別のメニューが開き、ファイルパラメータを選択します:mrc、整数として保存し、さらに別のダイアログで、保存するファイル名を選択します。データは、SerialEM独自のユーザー設定ではなく、適切なデータ領域に保存してください。システムが存在するCディスクには大きなデータを保存しないことをお勧めします。 取得が完了すると、モンタージュがメインウィンドウに表示されます(図4)。TEMと同じように、ナビゲーターのマーカーとポイントを使用してグリッド内を移動できるようになりました。 乱視矯正を再確認してください。通常、小さな領域をすばやくスキャンし、焦点と一緒に調整して、金ナノ粒子などの点状の特徴が高倍率で(SEMのように)焦点を合わせたり外れたりするときに完全に丸いままになるようにすれば十分です。より控えめに言えば、乱視を修正する前に、ステップ1.5〜1.8の直接整列を繰り返すことができます。 高倍率の画像をLMモンタージュに合わせます。LMモンタージュ上の位置に移動し、簡単に認識できる機能を使用します。ポイントを追加し、[ ナビゲーター] ウィンドウ > [ポイントの追加] をクリックして、フィーチャをクリックします。もう一度押す(追加を停止する)と非アクティブ化されます。 最低の高倍率(HM)でビューまたはトライアル画像を撮影し、指定されたアイテムを見つけます。図 5 に示すように、マーカーをそこに配置 (緑色の十字) し、[ナビゲーター] ウィンドウで対応するポイントを強調表示した状態で、[ナビゲーター] メニューの [マーカーにシフト…] >開いたダイアログで [すべてのマップ] と [Shift の保存] を選択します。 ステージを他の位置に移動し、HM画像がLMモンタージュで選択したのと同じ位置の中央にあることを確認してテストします。特徴がHM画像に表示されない場合は、LMモードとHMモード間のシフトが大きすぎる可能性があります。この場合、より広い領域にポリゴンモンタージュを作成します。[ ナビゲーター] ウィンドウ > [ポリゴンの追加] をクリックし、いくつかのポイントを選択してから、もう一度 [ ポリゴンの追加] をクリックして閉じます。[ ナビゲーター]メニューをクリックして、[モンタージュとグリッド]>>[ポリゴンモンタージュの設定]をクリックし、[開始]>モンタージュコントロールをクリックします。次に、上記のように対応するポイントを見つけて、[ マーカーに移動]をクリックします…。 低線量モードを設定します。低線 量管理 タブを開き、 低線量モード ボックスをチェックします。 [継続的な更新]をオンにして、[表示]に移動します。このモードの顕微鏡倍率(通常は最低または最低の隣)を選択します。次の各モードを選択し、適切な倍率を設定します。レコードは目的のピクセルサイズになるように設定する必要があり、フォーカス倍率は、焦点を合わせるための基準マーカーまたはその他の高コントラストの特徴が明確に解決されるのに十分な高さである必要があります。次に、すぐに[継続的更新]のチェックを外します。注意: 試用モードは、露出を最小限に抑えるためにトラッキング領域を記録領域から移動させるか、周囲の大部分を含む低倍率に設定することができます。 ビュー画像を取得し、エリアの位置を定義:トライアルを使用してトライアル位置を設定します。注:推奨事項#1:サンプリングされた領域と時間の変化を考えると、低マグトライアルの追加曝露は最小限に抑えられる可能性があります。グリッド バーが視野に入らない限り、通常、この追跡方法はより信頼性が高くなります。推奨事項#2:フォーカスなどのさまざまなモードの線量を調整するために、スポットサイズを更新することもできます。顕微鏡の光学系設定を安定させるために、これを行わず、スポットサイズを記録に適したままにして、必要に応じて露光時間を調整することをお勧めします。 低線量制御タブ>[記録に移動]をクリックし、[ナビゲーター]メニューをクリックして>[イメージング状態を開く]>[現在の状態を追加]をクリックします。簡単に思い出せるように名前を付けます(例:マイクロプローブSTEMの場合はμP STEM)。さまざまなタスクに対してさまざまな状態を定義できます。 トモグラフィーの対象となる場所にステージを移動します(ナビゲーターの使用については以下を参照)。ナビゲータにポイントを追加するには、[ ナビゲータ] ウィンドウ > [ポイントの追加] をクリックします。 真心の高さを調整するには 、[タスク]>[真心度]>[ラフ]を選択します。[ナビゲーター] ウィンドウ > [Z を更新] をクリックします。 フォーカスとトライアルの領域を設定します。まず、ビュー画像を撮影します。次に、[ 低線量管理 ]タブの[ 領域の位置の定義]で、[ フォーカス]または[試験]を選択します。傾斜軸に沿って 2 つの領域の位置を調整します。フォーカスは [レコード] 領域と重ならないようにする必要があります。注意: 特に左端にオーバーシュートがあるため、どちらも[記録]領域のすぐ隣に設定しないでください。オーバーシュートの程度は、記録倍率で繰り返しスキャンし、倍率を下げてより広い視野を得ることで、テスト領域で評価できます。 適切な測定(経験上オプション)のために、ビューまたはプレビュー画像を撮影するたびにステージを+60°に傾けてから-60°に傾けて、グリッドバーが緑色で表示されているレコード領域の視野に入らないようにします。 チルトシリーズを設定します。新しいファイルを開いてデータを保存するには 、[ファイル] > [新規作成 ] をクリックし、ファイル名を選択します。[ チルトシリーズ]メニュー>[チルトシリーズセットアップ ]を選択します(図6)。トラブルシューティング: [新規開く ]ボタンが灰色の場合は、前のチルトシリーズが終了していることを確認してください。そうでない場合は、[ シリーズを傾ける] > [終了] をクリックして終了します。 [傾斜]ボックスと[終了]ボックスの極端な傾斜角度(通常-60°と+60°)と、増分(通常2°)を設定します。 線量対称モード(推奨-低線量モードがまだアクティブであることを確認してください)の場合、 ___から2方向にシリーズを実行するにチェックを入れます。ブランクは通常0ですが、事前に傾いたFIBラメラを補正するために使用できます(たとえば、20°)。 わかりやすくするために、[ 露出時間を一定に保つ] をオンにします。これを変更するには、露出計算のやり直しが必要であり、投影強度を元のデータと比較する代数再構成(ART/SART/SIRTなど)にも干渉する可能性があります(ステップ7.1を参照)。 [ オートフォーカスをスキップする]をオンにします。1 mradなどの小さな半収束角は、焦点を合わせる必要がないほど長い被写界深度を意味します。テストとして、0°で焦点を合わせ、60°または-60°に傾けて、 記録を押します。焦点を維持することは、主に正確なユーセントリックの高さの問題です。より大きな収束のために、シリーズの間に焦点を合わせる必要があるかもしれません。この場合、ビューを取り、[ 低線量制御 ]タブで、領域と焦点の位置を定義し、焦点領域を調整します。 初期アクションと最終アクション:ユーセントリック高さ調整が正確に行われた場合、それを繰り返す必要はありません。チェックを外し ます シリーズの終わりにカラムバルブを閉じる そうしない正当な理由がない限り。 制御パラメータを追跡するために、多くのオプションがあります。無人データ収集の場合、最優先事項は、ユーザー入力のためにプログラムが停止しないようにすることです。推奨設定を使用する: フィールドの損失率が 5 を超える場合は [記録] を繰り返します。次に、後にトラックし、新しいトラック参照 を取得する前にプレビューと整列 し、レコードアライメントが2%異なる場合は 新しいトラック参照を取得します 。有人データ収集では、より厳格なパラメータを適用して、何時間もの機器時間を失うリスクを回避します。 開始する準備ができたら、ウィンドウの下部にある [GO ]を押します。最後に、[ シリーズを傾ける] > [終了] を選択します。 5. ナビゲータを使用した複数ポイントでのバッチ取得 (拡張 #1) 注:プロトコルは、a)TEMと同一であり、b)完全な説明を時代遅れにする可能性のある新しいツールが利用可能になりつつあるため、初歩的なものです。 フルグリッドモンタージュをメインウィンドウにロードします。 有望に見えるいくつかの領域を選択してください。[ ポイントの追加 ] をクリックし、選択したグリッドの四角形の中心に追加します。もう一度 [ ポイントを追加 ] をクリックして、モードを無効にします。 低線量イメージング状態をアクティブにした状態で、[ナビゲーター]ウィンドウを選択し>選択した各正方形の[アイテムで取得]と[アイテムの新しいファイル]をオンにします。最初に、ファイルのプロパティ(図7)のダイアログが開き、次にファイル名が表示されます。モンタージュ画像を選択し、[モンタージュ設定]ダイアログ(図8)で、[低線量モードでビューパラメータを使用]をオンにして、正方形を覆うのに十分な大きさ(約100 x 100 μm)のグリッドを作成します。 ナビゲーターメニュー>アイテムで取得]をクリックし、マッピングのパラメーターを選択します。最も重要なのは、[プライマリ アクション] で [ナビゲーター マップの作成]、[大まかな等心度]、[細かい等心度] の順にチェックし、[実行] を押すことです (図 9)。200メッシュのグリッドの場合、これにより、ほぼ正方形全体のマップが生成されます(図10) 断層撮影位置の選択を準備します。[ ファイル] > [新規作成] をクリックして、新しいファイルを開きます。ファイル名を付けます (例: AnchorMaps.mrc)。低線量モードをアクティブにして、 カメラ&スクリプト>セットアップ に入り、表示とプレビューが同じビニングになっていることを確認します(そうしないと、同じファイルに保存できません)。 正方形のマップ内のポイントにアクセスするには 、[ナビゲーター] ウィンドウ > [XYZ に移動] をクリックします。 マーカー付きの最初の断層撮影の位置を選択します。プレビュー画像を取得し、マウスの右ボタンでドラッグして位置を調整します。次に、[ ナビゲーター ウィンドウ] > [新しいマップ] を選択し、ダイアログで [ はい ] をクリックして保存します。次に、同じエリアのビュー画像を取得し、もう一度新しいマップとして保存します。[ビュー] マップが強調表示されていることを確認し、右上の [ナビゲーター] ウィンドウで [ アンカー状態] をオンにします。 2番目の位置を選択し、もう一度プレビューを実行して上記のように場所を絞り込み、今度はナビゲーターウィンドウで アンカーマップ を押します。これにより、プレビューとビューの両方がナビゲーターに新しいマップとして保存されます。 目的のすべての場所に対して手順5.5.4を繰り返します。あるグリッドの正方形から別のグリッドの正方形に移動するには、点を選択し、[ナビゲータ]ウィンドウで[ XYZに移動 ]を押します。 参照フォーカスの場合は、グリッドの明確な領域を選択し、手またはオートフォーカスで慎重に焦点を合わせます。顕微鏡パネルの [焦点ぼけをリセット ]を押します。[ スクリプト>編集] > [編集 15 ] (または別の空き番号) をクリックして SerialEM でスクリプトを作成し、ScriptName SetDefocus と SetDefocus 0 の 2 行を入力します。 「ナビゲータ」ウィンドウで、最初の場所 (「プレビュー」または「表示」) をハイライト表示します。Shift-Tを押してから最後の位置を強調表示し、もう一度Shift-Tを押します。[ファイルのプロパティ]ダイアログが開きます。ファイル名を含めて保存する単一フレームの画像とパラメータを選択します。ファイル名を編集しますが、項目ラベルは最後に残します。注意: 数字で終わるファイル名は、連続するチルトシリーズで自動的に更新されます。[ ナビゲーター]メニュー>[ナビゲーション]オプション>[ファイル名にアイテムラベルを使用する]オプションを使用すると便利です。 次に、チルトシリーズセットアップメニューが自動的に開きます。前と同じように充填しますが(図6)、真心を調整は選択しないでください。ナビゲーターのプレビューポイントがTSとしてマークされます。このメニューに戻るには、項目リストの上にある「ナビゲータ」ウィンドウのボタンを使用します。 [ナビゲーター] メニュー > [アイテムの取得] を選択します。今回は、最終データのパラメータを選択します。プライマリアクション:傾斜系列を取得を選択し、デュワー/真空の管理、アイテムに再調整、精密ユーセントリシティ、アクションの前にスクリプトを実行を選択し、Sクリップで実行します:SetDefocus。一般オプションを選択します:エラーが発生したときにメッセージボックスを表示せず、最後にカラムバルブを閉じてからGOを押します(図11)。SerialEMは、すべてのアンカーマップを訪問し、各位置で傾斜系列を記録します(図12)。 6. CLEM マップの登録 (拡張機能 #2) まだ行っていない場合は、完全なグリッドモンタージュをメインウィンドウにロードし、[ウィンドウ] >[新しいウィンドウ ]をクリックして新しいウィンドウを作成し、名前を付けます。完全なグリッドモンタージュが登録 1 に表示されることに注意してください。 [ ナビゲーター] メニュー > [マップのインポート] をクリックして、CLEM マップ イメージをインポートします。登録 2 に入るはずです。上記のように新しいウィンドウを割り当てることもできます。 CLEM マップを調べて、完全なグリッド モンタージュに対する相対的な回転を決定します。グリッドバーが表示されているマップ上でこれを行うのが最も簡単です。マップが反転することもあることに注意してください。 [ナビゲーター]メニューの[マップの回転]を使用して大まかに位置合わせ>、必要に応じて[反転]を使用します。注:次の手順でもフリップに対応できますが、事前にフリップを行うと、次の作業がはるかに簡単になります。この手順は、アライメントが満足のいくものになるまで繰り返すことができますが、正確である必要はありません。 正確な位置合わせのための基準点を導入します。対応する点を一方のウィンドウに配置し、次にもう一方のウィンドウに配置します。このようなポイントごとに、[ナビゲーター] ウィンドウの最上部にある [登録ポイント ] をオンにします。対応するポイントには昇順インデックスのラベルが付けられ、その後にグリッド モンタージュまたはインポートされたマップの R1 または R2 が続きます。注:ファインダーグリッドを使用すると、この手順が非常に簡単になります。それ以外の場合は、中央マーカーやグリッド四角形のコーナーなどのソリッド フィーチャを選択します。原則として、大まかなアライメントには3ポイントで十分ですが、より多くのポイントはモンタージュ構造の小さな不一致を補うのに役立ちます。 CLEM マップの複数のチャンネルが必要な場合 (たとえば、異なる蛍光色や明視野背景のない蛍光など)、上記の手順 6.2 のようにそれらをインポートし、登録を 2 に変更します。このようにして、最初のマップから登録ポイントを継承します。 ナビゲーターメニュー>変換項目による登録を強制します。対応する基準地点がすべてのマップに表示され、登録 1 に表示されます。視覚的に整列するには、[ナビゲーター] メニュー> [マップの回転] をクリックします。[ナビゲーター] ウィンドウからマップを読み込む場合、[読み込み時に回転] ボックスがオンになっていない限り、マップは自動的に回転されないことに注意してください。これは、[ナビゲーター] ウィンドウからいつでも回転できます。 これで、マーカーまたはポイントを蛍光マップに配置し、ステージをグリッド上の対応する位置に移動できるようになります(図13)。 7.3D再建 これには、TEM断層撮影と同じ基本的なステップが含まれます:傾斜系列のアライメントとそれに続く典型的な後方投影。いくつかのソフトウェアプラットフォームが利用可能であり、CTF補正をスキップする必要があることを除いて、データはTEMデータと同様に扱うことができます。 強度正規化を適用して、高傾斜投影の寄与を高めたり、シリーズ中の照明の変化のバランスを取りますが、定量的な情報が影響を受けることに注意してください。たとえば、IMOD26 はうまく機能しますが、AreTomo27 は基準のないアライメントに非常に役立ちます。基準パーティクルが存在する場合、ClusterAlign28 は個々のスポットではなくクラスターとしてそれらをたどることができます。これは、高コントラストの特徴によってスポットが失われたり隠れたりする可能性のあるSTEMデータに特に役立ちます。 3Dデコンボリューション29 による再構成に続いて、コントラストの向上とノイズ除去を行います。再構築したら、オルソスライスや等値面セグメンテーションなどの標準的な方法のいずれかでSTEM体積データを表します。特に、強度分布は単極であり、従来の位相コントラストTEMに現れるコントラスト反転やフーリエ縞はありません。一般に、STEM断層像の興味深い表現手段は、明視野を反転させることです(図14)。その効果は「X線の目」の効果であり、清澄化されたセル30を通して関心のある高密度の物体を見る。