慢性肝纤维化小鼠模型用于研究胆道闭锁

本研究获得广州市永诺生物医学动物中心机构动物护理与使用委员会（IACUC-AEWC-F2208020）的批准，所有动物实验均在该委员会进行。 1.慢性纤维化BA小鼠模型的建立 注意：所有动物都在同一房间的特定无病原体（SPF）环境中饲养，实验在常规环境中进行。将妊娠第12.5天（年龄：10-12周;体重35-40g）的BALB / c小鼠保存在25°C的无特定病原体的房间中，在12小时黑暗/光照循环下，并免费获得高压灭菌的食物和水。出生后24小时内（平均体重：1.5-1.6g）选择新生小鼠用于小鼠BA模型。 按照之前的报告准备RRV16。注意：由于模型小鼠的存活状态较差，它们需要在21天大时分开，以避免它们被同一笼子里的其他小鼠咬伤甚至杀死。 将新生小鼠分为三组：对照组，RRV组和RRV +抗Ly6G组。在出生后24小时内腹膜内向新生小鼠注射20μLRRV（滴度：1.5 x 106PFU / mL）（RRV组）或盐水（对照组）。为了耗尽Gr-1 + 细胞，在RRV注射前4小时腹膜内注射5μg抗Ly6G抗体预处理每只小鼠。注意：抗Ly6G抗体溶液储存在2-8°C，不应冷冻。使用前取出抗体，在室温下加热30分钟。 每3天向小鼠腹部注射10μg抗Ly-Ly6G抗体，直到RRV注射后第12天（图1A）。 每天检查并记录所有小鼠的外观、体重和存活率。 2.腹腔注射小鼠 将新生小鼠从笼子中取出。使用 1 mL 胰岛素注射器注射 20 μL RRV 溶液或 50 μL 抗 Ly6G 抗体溶液。一只手的食指和拇指捏住幼鼠的颈部皮肤，用无名指和尾指轻轻握住小鼠的后腿，露出腹部。 向上倾斜抬起针头。将针头插入鼠标右后腿的中大腿，与皮肤成15°角。沿着皮下路径移动直到针到达小鼠的右肋边缘后，将针向下引导到腹腔中。然后，将液体注射到小鼠肝脏下。注意：新生小鼠的胃和脾脏在左腹部。如果在左侧插入针头，很容易刺穿胃或引起脾出血。 注射后立即拔出针头，观察注射部位是否有出血或渗漏。如果有，请用高压灭菌的棉擦拭。将鼠标放回母亲的笼子里。注意：为了减少注射过程中液体泄漏对实验结果的影响，请确保注射动作轻柔，慢慢取出针头，用棉签按压注射部位30秒。 3. 采集样本组织 在第12天，用4%异氟醚吸入麻醉小鼠，并在显微镜下解剖它们。将1mL胰岛素注射器插入心脏左心室以收集血液。采血后，通过吸入4%异氟醚10分钟对小鼠实施安乐死。在室温下以400× g 离心血液5分钟，并分离血清进行肝功能测量。注意：必须在小鼠活着时进行采血。如果小鼠死亡，血液将保留在血管中，无法收集。 拍摄肝脏和胆管的一般外观。随后，用剪刀和镊子从周围组织中解剖小鼠肝脏和脾脏。注意：收集肝脏和其他组织并将其保存在-80°C下用于RNA和蛋白质提取，或浸泡在10%福尔马林中以制备组织学标本。 4.肝外胆管荧光素血管造影 对小鼠实施安乐死后，用剪刀和棉签完全暴露肝脏、胆囊和肝外胆管。 在姿势显微镜下观察，用1 mL胰岛素注射器将5-10μL荧光染料罗丹明123（20mg / mL）注入胆囊，并拍照。此过程与之前16 中报告的过程相同。注意：同一组中的不同小鼠用于样品组织收集和荧光血管造影。 5. H&E 染色 将新鲜小鼠肝组织浸入10%福尔马林中24小时。 将组织嵌入石蜡中后，使用石蜡切片机将石蜡块切成厚度为4μm的部分，并在同一载玻片上放置两个连续的切片。要求有经验的人员规范操作，避免割伤手指17. 将切片放入切片架中，用二甲苯脱蜡，依次在无水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇和蒸馏水中水合，并分别浸泡5分钟。 用苏木精溶液染色切片5分钟，然后将它们浸泡在1%盐酸和75%酒精中5秒。用清水冲洗切片，并用伊红溶液染色1分钟。 6. CK19和F4/80免疫组化染色 前三个步骤与H&E染色部分中的组织包埋，切片和脱蜡步骤相同。 使用Tris-EDTA缓冲液（10 mmol/L Tris碱，1 mmol/L EDTA溶液，pH 9.0）进行抗原修复，在95°C的微波炉中加热切片10分钟，然后取出并自然冷却至室温。 将组织切片置于3%过氧化氢溶液中10分钟以除去内源性过氧化物酶。 用5%山羊血清处理切片以阻断非特异性结合。 向切片中加入原代大鼠抗小鼠细胞角蛋白19或大鼠抗小鼠F4 / 80单克隆抗体，并在4°C孵育过夜。 在室温下用适当的二抗孵育切片30分钟。 使用3，3′-二氨基联苯胺（DAB）作为显色剂，在显微镜下观察显色反应。 在40倍显微镜下观察切片以获得图片，并根据需要进行分析。 7.天狼星红染色 执行组织包埋，切片和脱蜡的前三个步骤，如H&E染色部分所述。 组织切片用苏木精复染后，在室温下用50μL天狼星红染料溶液覆盖每个组织1小时。 在室温下自然干燥载玻片4小时，向每张载玻片中加入一滴中性口香糖，并使用盖玻片缓慢覆盖组织以避免气泡。将载玻片在室温下放置24小时以固化中性胶。 使用偏振对比光显微镜观察胶原蛋白沉积的细节;选择清晰合适的视野，调整显微镜视野的亮度和白平衡。获取图像，并根据需要在40倍显微镜下进行分析。