Adipocyt-specifieke ATAC-Seq met vetweefsels met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernsortering

Vetweefsel, dat gespecialiseerd is voor het opslaan van overtollige energie in de vorm van lipidemoleculen, is een belangrijk orgaan voor metabole regulatie. De strikte controle van de vorming en het onderhoud van adipocyten is van vitaal belang voor de vetweefselfunctie en de energiehomeostase van het hele lichaam¹. Veel transcriptionele regulatoren spelen een cruciale rol bij de controle van adipocytendifferentiatie, plasticiteit en functie; Sommige van deze regulatoren zijn betrokken bij metabole stoornissen bij de mens ^2,3. Recente ontwikkelingen in high-throughput sequencingtechnieken voor genexpressie en epigenomische analyse hebben de ontdekking van de moleculaire regulatoren van adipocytenbiologie verder vergemakkelijkt⁴. Moleculaire profileringsstudies met behulp van vetweefsels zijn een uitdaging om uit te voeren vanwege de heterogeniteit van deze weefsels. Vetweefsel bestaat voornamelijk uit adipocyten, die verantwoordelijk zijn voor vetopslag, maar bevat ook verschillende andere celtypen, zoals fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen⁵. Bovendien is de cellulaire samenstelling van vetweefsel dramatisch veranderd als reactie op pathofysiologische veranderingen zoals temperatuur en voedingsstatus⁶. Om deze problemen te overwinnen, hebben we eerder een transgene reportermuis ontwikkeld, genaamd Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), die GFP-gelabelde ribosomen en mCherry-gelabelde biotinyleerde kernen produceert op een Cre-recombinase-afhankelijke manier⁷. Het dual-labeling systeem maakt het mogelijk om celtype-specifieke transcriptomische en epigenomische analyse uit te voeren met weefsels. Met behulp van NuTRAP-muizen gekruist met adipocyt-specifieke adiponectine-Cre-lijnen (Adipoq-NuTRAP), hebben we eerder genexpressieprofielen en chromatinetoestanden van pure adipocytenpopulaties in vivo gekarakteriseerd en bepaald hoe ze worden veranderd tijdens obesitas ^7,8. Eerder stelden NuTRAP-muizen gekruist met bruine en beige adipocyt-specifieke Ucp1-Cre-lijnen (Ucp1-NuTRAP) ons in staat om de epigenomische remodellering van de zeldzame thermogene adipocytenpopulatie, beige adipocyten, te karakteriseren als reactie op temperatuurveranderingen⁹.

ATAC-seq is een veelgebruikte analysemethode om de toegankelijkheid van genoombrede chromatine te beoordelen. De hyperreactieve Tn5-transposase die in ATAC-seq wordt gebruikt, maakt de identificatie van open chromatinegebieden mogelijk door sequencingadapters te taggen in het chromatine-toegankelijke gebied van^{kernen 10}. ATAC-seq is een eenvoudige methode, maar biedt robuuste resultaten en is zeer efficiënt, zelfs met monsters met een lage invoer. Het is dus een van de meest populaire epigenomische profileringsmethoden geworden en heeft bijgedragen aan het begrip van de regulerende mechanismen van genexpressie binnen diverse biologische contexten. Sinds het oorspronkelijke ATAC-seq protocol is gemaakt, zijn er verschillende ATAC-seq-afgeleide technieken verder ontwikkeld om het protocol voor verschillende soorten samples aan te passen en te optimaliseren. Fast-ATAC is bijvoorbeeld ontworpen voor het analyseren van bloedcelmonsters¹¹, Omni-ATAC is een geoptimaliseerd protocol voor ingevroren weefselmonsters 12 en MiniATAC-seq is effectief voor embryo-analyse in een vroeg stadium¹³. Het toepassen van de ATAC-seq-methode op adipocyten, vooral uit weefselmonsters, is echter nog steeds een uitdaging. Naast de heterogeniteit van vetweefsel kan het hoge lipidegehalte interfereren met efficiënte recombinatiereacties door Tn5-transposase, zelfs na kernisolatie. Bovendien veroorzaakt het hoge mitochondriale gehalte in adipocyten, met name in bruine en beige adipocyten, een hoge mitochondriale DNA-contaminatie en verspilde sequencing-reads. Dit artikel beschrijft een protocol voor adipocyt-specifieke ATAC-seq met behulp van Adipoq-NuTRAP-muizen (figuur 1). Door gebruik te maken van fluorescentie-gelabelde kernsortering, maakt dit protocol het mogelijk om zuivere populaties van adipocytenkernen weg te verzamelen van andere verstorende celtypen en de efficiënte verwijdering van lipiden, mitochondriën en weefselresten. Daarom kan dit protocol celtypespecifieke gegevens van hoge kwaliteit genereren en verspilling van mitochondriale metingen minimaliseren, terwijl een verminderde hoeveelheid invoer en reagentia wordt gebruikt in vergelijking met het standaardprotocol.