치료용 하이드로겔 조사를 위한 교모세포종 재발 절제 후 모델

모든 동물 실험은 난징 의과 대학의 기관 검토위원회와 동물 윤리위원회 (IACUC-1904004)의 승인과 감독을 받았습니다. 생후 6-8주령의 C57BL/6J 암컷 마우스를 본 연구에 사용하였다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조). 1. 동물 준비 생쥐의 체중을 측정하고 50mg/kg 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사하여 마취합니다(재료 표 참조). 수술 전후 진통을 위해 멜록시캄(5mg/kg; i.p.)을 투여합니다. 12시간/12시간의 명암 주기, 주변 온도 24°C, 상대 습도 50%의 케이지에 마우스를 수용합니다.참고: 본 연구의 경우, 마우스의 초기 무게는 약 22g이었다. 실험실 동물 면도기를 사용하여 마우스 머리의 머리카락을 제거하고 머리와 팔다리를 정위 장치에 고정합니다 ( 재료 표 참조).알림: 사용하기 전에 모든 장비를 소독하십시오. 클로르헥시딘 또는 포비돈 요오드 스크럽을 최소 3회 번갈아 가며 알코올로 마우스의 머리를 소독하고 멸균 수술용 드레이프로 마우스를 덮습니다. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 용 연고를 바르십시오. 안과 용 가위로 오른쪽 이마 상단의 정중선을 따라 마우스의 두피를 약 1cm 자릅니다.참고: 절개하기 전에 페달 반사가 없어 마취의 수술 평면을 확인하십시오. 헤링본 솔기와 전면 폰타넬 지점이 같은 높이에 위치하도록 정체 장치를 조정합니다. 2. 동소 두개내 GBM 모델의 구성 용담 바이올렛2 를 적신 면봉을 사용하여 전면 폰타넬의 앞면으로 1mm, 전면 폰타넬의 오른쪽으로 1.8mm, 전면 폰타넬에서 아래로 3mm 떨어진 지점을 표시합니다( 재료 표 참조). 직경 1mm의 미니 두개골 드릴( 재료 표 참조)을 사용하여 점을 뚫어 직경 약 1mm, 깊이 1mm의 기공 크기를 만듭니다. 멸균 면봉으로 삼출 된 뇌척수액을 제거하십시오. 5 μL의 종양 세포 현탁액(GL261-Luci, 5 × 105 세포 현탁 5 μL의 PBS)을 미세 주사기로 흡인합니다.참고: GL261-Luci는 상용 소스에서 구입했습니다( 재료 표 참조). 미세 주사기의 바늘 끝을 두개골 드릴링 구멍에 수직으로 맞추고 바늘 끝이 두개골 평면에 3mm 들어갈 때까지 삽입하고 바늘을 0.5mm 뒤로 되돌립니다7. 마이크로시린지를 열고 1μL/min의 속도로 주입합니다. 주사 후 10 분 동안 바늘을 유지하십시오. 마이크로 주사기를 천천히 빼내고 멸균 된 마른 면봉으로 주입 지점을 누릅니다. 비흡수성 수술용 봉합사(10-0, 재료 표 참조)로 두피를 봉합하고 절개 부위를 다시 소독합니다. 동물의 건강 상태를 모니터링하고 따뜻한 상태로 유지하십시오. 마우스가 깨어난 후 마우스를 하우징 케이지로 다시 이동합니다. 생체 내 생체 발광 이미징 시스템(재료 표 참조)으로 마우스를 이미지화하여 종양 보유 후 10일째에 이식된 종양을 검출합니다.참고: GBM 세포에 로딩된 루시페라아제인 GL261을 생체발광 이미징에 사용했습니다.산소 유량이 0.6L/min인 1.5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 페달 반사 부족으로 마취 깊이를 확인한 후 플루오레세인칼륨(10mg/mL, 재료 표 참조)을 마우스에 복강 주사하고 11초 후 생체 발광 이미징을 수행합니다. 형광 값이 ~5 × 105에 도달하면 절차가 성공한 것입니다.참고: 이미징하기 전에 동물을 마취하십시오. 기화된 이소플루란과 함께 공급되는 노즈 콘을 통해 마취를 유지하십시오. 종양 보유에 성공한 마우스를 선택하여 GBM 재발 절제 후 모델을 구성합니다. 3. GBM 재발 절제 후 모델 구축 동소 두개내 GBM 모델 마우스의 종양 크기가 ~6.5 × 105가 되면 수술 후 재발 모델에 대한 마우스를 선택합니다. 동소 두개내 GBM 모델 마우스의 무게를 측정하고 50mg/kg 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 수술 전후 진통을 위해 멜록시캄(5mg/kg; i.p.)을 투여합니다. 1.2-1.5 단계의 과정을 반복하십시오. 두피 조직과 두개골을 분리하고 동소 두개내 GBM 모델을 구축하는 데 사용된 드릴링 구멍을 확인합니다. 구멍이 치유되면 정위 장치를 사용하여 구멍을 식별하고 2.1-2.3 단계에서 언급 한 절차를 따르십시오. 두개골 드릴로 구멍 직경을 5mm로 확장하고 멸균 면봉으로 삼출 된 뇌척수액을 제거합니다. 현미경을 마우스 머리에 초점을 맞추고 드릴링 구멍이 시야 중앙에 위치하도록 설정을 조정합니다. 미세 가위로 수막을 자르고 현미경으로 마이크로 큐렛과 마이크로 메스로 종양 조직의 일부를 제거합니다.참고: 수막과 관련하여 두개골이 열리면 뇌 조직에 가까운 얇은 막이 수막입니다. 멸균 거즈로 출혈을 멈추고 멸균 생리 식염수로 절개 부위를 씻으십시오. 시중에서 판매되는 하이드로겔(10μL, 재료 표 참조)을 1mL 주사기로 절제된 구멍에 주입하고 비흡수성 수술용 봉합사(10-0)로 두피를 봉합한 다음 절개 부위를 다시 소독합니다(그림 1). 동물의 건강 상태를 모니터링하고 마우스를 따뜻하게 유지하십시오. 마우스가 깨어난 후 마우스를 하우징 케이지로 다시 이동합니다. 1일 후에 이식된 종양을 검출하기 위해 생체 내 발광 이미징을 수행하여 잔류 종양의 크기를 정량화합니다(그림 2 및 그림 3). 종말점까지 2일마다 마우스의 무게를 잰다.참고: 본 연구의 경우, 최종 종점은 30일이었고, 마우스는 복강내 주사와 함께 펜토바르비탈 나트륨의 과다 투여에 의해 안락사되었습니다.