治療用ヒドロゲル調査のための膠芽腫再発切除後モデル

すべての動物実験は、南京医科大学の治験審査委員会と動物倫理委員会(IACUC-1904004)によって承認および監督されました。6〜8週齢のC57BL / 6J雌マウスを本研究に使用しました。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。 1.動物の準備 マウスの体重を量り、50 mg / kgペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で麻酔します(材料表を参照)。周術期鎮痛のためにメロキシカム(5mg / kg;i.p.)を投与します。.マウスをケージに12時間/12時間の明暗サイクル、周囲温度24°C、相対湿度50%で収容します。注:本試験では、マウスの初期体重は約22gであった。 実験動物のシェーバーを使用してマウスの頭の毛を取り除き、頭と手足を定位固定装置に固定します( 材料表を参照)。注意: 使用前にすべての機器を滅菌してください。 マウスの頭部を少なくとも3回のクロルヘキシジンまたはポビドンヨードスクラブとそれに続くアルコールで消毒し、マウスを滅菌外科用ドレープで覆う。乾燥を防ぐために両目に眼科用軟膏を塗ります。 マウスの頭皮を眼科用ハサミで右額上部の正中線に沿って約1cm切ります。注:切開を行う前に、ペダル反射がないことで麻酔の手術面を確認してください。 固定装置を調整して、ヘリンボーンの縫い目と前面の泉門ポイントが同じレベルにあることを確認します。 2. 同所性頭蓋内GBMモデルの構築 ゲンチアナバイオレット2を浸した綿棒を使用して、前面泉門の前面に1 mm、前面泉門の右側に1.8 mm、前面泉門から 3 mm下のポイントに印を付けます( 材料表を参照)。 直径1 mmのミニ頭蓋ドリル( 材料表を参照)を使用してポイントをドリルし、直径約1 mm、深さ1 mmの細孔サイズを作成します。 滲出した脳脊髄液を滅菌綿棒で取り除きます。 5 μLの腫瘍細胞懸濁液(GL261-Luci、5 μLのPBSに懸濁した5 × 105 細胞)をマイクロシリンジで吸引します。注意: GL261-Luciは市販のソースから入手しました( 材料表を参照)。 マイクロシリンジの針先を頭蓋骨のドリル穴に垂直に合わせ、針先が頭蓋骨面に3 mm入るまで挿入し、針を0.5 mm7戻します。 マイクロシリンジを開き、1μL/minの速度で注入します。 注射後10分間針を保持します。 マイクロシリンジをゆっくりと引き出し、滅菌乾燥綿球で注入ポイントを押します。 非吸収性の外科用縫合糸(10-0、 材料表を参照)で頭皮を縫合し、切開部を再度消毒します。 動物の健康状態を監視し、暖かい状態に保ちます。 マウスがウェイクアップしたら、マウスをハウジングケージに戻します。 in vivo生物発光イメージングシステム(材料表を参照)でマウスを画像化し、担癌後10日目に移植腫瘍を検出します。注:GBM細胞にロードされたルシフェラーゼGL261を生物発光イメージングに使用しました。0.6L/minの酸素流量で1.5%イソフルランでマウスに麻酔をかけます。ペダル反射の欠如による麻酔深度を確認した後、フルオレセインカリウム(10 mg/mL、 材料表参照)をマウス腹腔内注射し、11秒後に in vivo 生物発光イメージングを行います。蛍光値が~5 × 105に達すると、手順は成功します。注意: イメージングする前に動物に麻酔をかけてください。気化したイソフルランが付属するノーズコーンを介して麻酔を維持します。. 担癌に成功したマウスを選択し、GBM再発切除後モデルを構築した。 3. GBM切除後再発モデルの構築 同所性頭蓋内GBMモデルマウスにおける腫瘍サイズが~6.5×105になった時点で、術後再発モデル用のマウスを選択する。 同所性頭蓋内GBMモデルマウスの体重を量り、50 mg / kgペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でマウスに麻酔をかけます。周術期鎮痛のためにメロキシカム(5mg / kg;i.p.)を投与します。. 手順1.2−1.5のプロセスを繰り返します。 頭皮組織と頭蓋骨を分離し、同所性頭蓋内GBMモデルの構築に使用したドリル穴を確認します。穴が治癒した場合は、定位装置を使用して穴を特定し、手順2.1〜2.3に記載されている手順に従います。 頭蓋骨ドリルで穴の直径を5 mmに拡大し、滅菌綿棒で滲出した脳脊髄液を取り除きます。 顕微鏡をマウスの頭に合わせ、設定を調整して、ドリル穴が視野の中央に配置されるようにします。 マイクロハサミで髄膜を切断し、顕微鏡下でマイクロキュレットとマイクロメスで腫瘍組織の一部を取り除きます。注:髄膜に関しては、頭蓋骨を開くと、脳組織に近い薄い膜が髄膜になります。 滅菌ガーゼで出血を止め、滅菌生理食塩水で切開部を洗浄します。 市販のハイドロゲル(10 μL、 材料表参照)を1 mLシリンジで切除腔内に注入し、非吸収性の外科用縫合糸(10-0)で頭皮を縫合し、切開部を再度消毒します(図1)。 動物の健康状態を監視し、マウスを暖かく保ちます。 マウスがウェイクアップしたら、マウスをハウジングケージに戻します。 1日後に移植腫瘍を検出するために in vivo 生物発光イメージングを行い、残存腫瘍の大きさを定量化した(図2 及び 図3)。 終端まで2日ごとにマウスの体重を測定します。注:本研究では、最終エンドポイントは30日目であり、マウスは腹腔内注射によるペントバルビタールナトリウムの過剰摂取によって安楽死させました。