Modèle post-résection de rechute de glioblastome pour les examens thérapeutiques de l’hydrogel

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées et supervisées par le Comité d’examen institutionnel et le Comité d’éthique animale de l’Université médicale de Nanjing (IACUC-1904004). Des souris femelles C57BL/6J, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). 1. Préparation des animaux Peser les souris et les anesthésier avec une injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital sodique (voir le tableau des matières). Administrer du méloxicam (5 mg/kg; i.p.) pour l’analgésie périopératoire. Hébergez les souris dans une cage sous un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h, une température ambiante de 24 °C et une humidité relative de 50 %.NOTE: Pour la présente étude, le poids initial des souris était d’environ 22 g. Enlevez les poils sur la tête d’une souris à l’aide d’un rasoir pour animaux de laboratoire et fixez la tête et les membres sur l’appareil stéréotaxique (voir le tableau des matériaux).REMARQUE : Stérilisez tout l’équipement avant utilisation. Désinfectez la tête de la souris avec au moins trois cycles alternés de gommage à la chlorhexidine ou à la povidone iodée suivie d’alcool, et couvrez la souris d’un champ chirurgical stérile. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement. Coupez le cuir chevelu de la souris à environ 1 cm le long de la ligne médiane sur le dessus du front droit avec des ciseaux ophtalmiques.NOTE: Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale avant de faire l’incision. Réglez l’appareil stéréotaxique pour vous assurer que la couture à chevrons et le point de fontanelle avant sont situés au même niveau. 2. Construction du modèle orthotopique de GBM intracrânien Marquez la pointe de 1 mm à l’avant de la fontanelle avant, de 1,8 mm à droite de la fontanelle avant et de 3 mm vers le bas à partir de la fontanelle avant à l’aide d’un coton-tige trempé dans du violet de gentiane2 (voir le tableau des matières). Percez la pointe à l’aide d’une mini-perceuse crânienne de 1 mm de diamètre (voir le tableau des matériaux) pour créer une taille de pores d’environ 1 mm de diamètre et 1 mm de profondeur. Retirez le liquide céphalorachidien exsudé à l’aide d’un coton-tige stérile. Aspirer 5 μL de suspension de cellules tumorales (GL261-Luci, 5 × 10 5 cellules en suspension dans5 μL de PBS) avec une microseringue.REMARQUE : Le GL261-Luci a été obtenu d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Alignez verticalement l’extrémité de l’aiguille de la microseringue avec le trou de forage du crâne, insérez jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille pénètre dans le plan du crâne sur 3 mm et retournez l’aiguille de 0,5 mm7. Ouvrez la microseringue et injectez à une vitesse de 1 μL/min. Conserver l’aiguille pendant 10 minutes après l’injection. Retirez lentement la microseringue et appuyez sur le point d’injection avec une boule de coton sec stérile. Suturez le cuir chevelu avec une suture chirurgicale non résorbable (10-0, voir le tableau des matériaux) et désinfectez à nouveau l’incision. Surveillez la santé de l’animal et gardez-le au chaud. Replacez la souris dans la cage de logement après le réveil de la souris. Imagez la souris avec un système d’imagerie bioluminescente in vivo (voir le tableau des matériaux) pour détecter la tumeur transplantée le 10e jour après la transmission de la tumeur.REMARQUE: La luciférase chargée dans les cellules GBM, GL261, a été utilisée pour l’imagerie bioluminescente.Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane à 1,5% avec un débit d’oxygène de 0,6 L / min. Après avoir confirmé la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale, injecter la fluorescéine de potassium à la souris par voie intrapéritonéale (10 mg/mL, voir le tableau des matériaux) et, 11 s plus tard, effectuer l’imagerie bioluminescente in vivo . Lorsque la valeur de fluorescence atteint ~5 × 105, la procédure réussit.REMARQUE : Anesthésiez l’animal avant l’imagerie. Maintenir l’anesthésie par le cône nasal fourni avec de l’isoflurane vaporisé. Sélectionnez les souris dont la tumeur est réussie pour construire le modèle de rechute post-résection du GBM. 3. Construction du modèle de rechute post-résection du GBM Lorsque la taille de la tumeur chez les souris modèles de GBM intracrâniennes orthotopiques devient ~6,5 × 105, sélectionnez les souris pour le modèle de rechute postopératoire. Peser les souris modèles orthotopiques intracrâniennes GBM et anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital sodique. Administrer du méloxicam (5 mg/kg; i.p.) pour l’analgésie périopératoire. Répétez le processus des étapes 1.2 à 1.5. Séparez le tissu du cuir chevelu et le crâne, et vérifiez le trou de forage utilisé pour construire le modèle de GBM intracrânien orthotopique. Si le trou est guéri, identifiez-le à l’aide d’un appareil stéréotaxique et suivez la procédure mentionnée aux étapes 2.1 à 2.3. Étendre le diamètre du trou à 5 mm avec une perceuse crânienne et retirer le liquide céphalorachidien exsudé avec un coton-tige stérile. Focalisez le microscope sur la tête de la souris et ajustez les paramètres pour vous assurer que le trou de forage est situé au centre du champ de vision. Coupez les méninges avec des microciseaux et retirez une partie du tissu tumoral avec une micro curette et un micro scalpel au microscope.REMARQUE: En ce qui concerne les méninges, lorsque le crâne est ouvert, la fine membrane proche du tissu cérébral est les méninges. Arrêtez le saignement avec de la gaze stérile et lavez l’incision avec une solution saline physiologique stérile. Injecter l’hydrogel disponible dans le commerce (10 μL, voir le tableau des matériaux) dans la cavité de résection à l’aide d’une seringue de 1 mL, suturer le cuir chevelu avec une suture chirurgicale non résorbable (10-0) et désinfecter à nouveau l’incision (Figure 1). Surveillez la santé de l’animal et gardez la souris au chaud. Replacez la souris dans la cage de logement après le réveil de la souris. Réaliser une imagerie bioluminescente in vivo pour détecter la tumeur transplantée 1 jour plus tard afin de quantifier la taille de la tumeur résiduelle (Figure 2 et Figure 3). Peser les souris tous les 2 jours jusqu’à l’extrémité terminale.REMARQUE : Pour la présente étude, le critère d’évaluation terminal était le jour 30, et les souris ont été euthanasiées par une surdose de pentobarbital sodique avec une injection intrapéritonéale.