Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

1. Eiwitproductie OPMERKING: In deze sectie wordt de procedure beschreven voor het isoleren van OmpF uit Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, dat LamB en OmpC mist, en TOM-kerncomplex uit Neurospora crassa (figuur 1)28,29. Dit laatste vereist mitochondriën geïsoleerd uit een N. crassa-stam 28 met een 6xHis-gelabelde vorm van de TOM-subeenheid Tom22 (figuur 1A), die kan worden geïsoleerd zoals beschreven28. De volgende protocollen leveren meestal 1-2 mg N. crassa TOM-CC en 10 mg E. coli OmpF op. Als de hoeveelheid moet worden aangepast, is het belangrijk dat de eiwit/wasmiddelverhoudingen nauwkeurig worden gehandhaafd. Tenzij anders aangegeven, moeten alle stappen worden uitgevoerd bij 4 °C. Isolatie van TOM-kerncomplexSolubilize gezuiverde N. crassa mitochondriën (2 g eiwit) verkregen door differentiële sedimentatie van ongeveer 1,5 kg (nat gewicht) schimmeldraden, volgens Bausewein et al.30, bij een eiwitconcentratie van 10 mg / ml in 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1% (w / v) DDM, 20% (v / v) glycerol, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) gedurende 30 minuten bij 4 °C.LET OP: PMSF is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Breng de opgeloste mitochondriën over in ultracentrifugebuizen en scheid de niet-opgeloste membranen van opgeloste membraaneiwitten door ultracentrifugatie bij 130.000 x g gedurende 40 minuten bij 4 °C en filtratie met filterpapier van standaardkwaliteit. Balanceer een voorverpakte Ni-NTA-kolom (volume van 5 ml) met ongeveer 5 kolomvolumes (CV) van buffer A1 (tabel 1) met behulp van een geautomatiseerd eiwitzuiveringssysteem. Voer de Ni-NTA-kolom uit met een constant debiet van 1 ml/min tijdens alle stappen. Gebruik een kolom met een lager volume (1 ml) als de eiwitten zijn geïsoleerd uit minder dan 2 g mitochondriën. Laad het opgeloste eiwitmonster op de Ni-NTA-kolom met een stroomsnelheid van 1 ml / min. Was de Ni-NTA-kolom met 5 CV buffer A1 (tabel 1) om ongebonden eiwitten te verwijderen. Elute His-tagged TOM-CC met 30% buffer A2 (tabel 1; 300 mM imidazool) en verzamel de eiwitpiek zoals deze voorkomt in het 280 nm chromatogram (figuur 1B). Voor verdere zuivering van TOM-CC moet de voorverpakte anionenuitwisselingskolom (1 ml) in evenwicht worden gebracht met elk 5 CV van buffer B1, B2 en B1 (tabel 1) met behulp van het geautomatiseerde eiwitzuiveringssysteem. Voer de anionenwisselkolom uit met een constant debiet van 1 ml/min tijdens alle stappen. Laad de TOM-CC-piekfractie (stap 1.1.6) op de anionenuitwisselingskolom (debiet van 1 ml/min). Verwijder de ongebonden eiwitten door de kolom te wassen met 5 CV buffer B1 (tabel 1) en een lineaire zoutgradiënt van 0%-20% buffer B2 (tabel 1). Elueer TOM-CC met een lineaire zoutgradiënt van 20%-35% buffer B2 en verzamel de eiwitpiekfractie zoals deze voorkomt in het 280 nm chromatogram (figuur 1C). Beoordeel de zuiverheid van het monster met SDS-PAGE (figuur 1D) en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een in de handel verkrijgbare eiwittest, volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel). Vries de eiwitmonsters in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C tot verder gebruik.LET OP: Vloeibare stikstof moet worden behandeld in goed geventileerde ruimtes. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.   Isolatie van OmpFHerstel de E. coli-stam BE BL21(DE3) omp6, zonder LamB en OmpC32, uit een bevroren glycerolvoorraad onder steriele omstandigheden en strijk op een Luria-Bertani (LB) agarplaat (tabel 2). Om dit te doen, verdeelt u het monster geleidelijk gelijkmatig over de hele plaat. Laat het monster 5 minuten in de agar weken, voordat u de plaat met gesloten deksel omkeert en een nacht bij 37 °C incubeert. Selecteer een enkele E. coli-kolonie , ent 7,5 ml LB-medium (tabel 2) met deze enkele kolonie met behulp van een steriele tandenstoker en laat een nacht (14 uur) groeien met roeren (170 tpm) bij 37 °C. Breng 2 x 1 ml E. coli-cellen met steriele pipetten over in 2 x 500 ml LB-medium (tabel 2) en laat een nacht (~ 14 uur) groeien bij 37 ° C met roeren (~ 170 rpm) in een shaker. Oogst de cellen door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C, vries de pellet in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.OPMERKING: Het natte gewicht van de celpellet is meestal 5 g per 1 L cultuur. Op dit punt kan het protocol worden gepauzeerd. Ontdooi en resuspensie van de cellen (2 g) in 20 ml lysisbuffer C1 (tabel 2) en passeer de suspensie driemaal bij 1.000 psi door een voorgekoeld (4 °C) hogedrukcelverstoringssysteem, met een maximaal monstervolume van 35 ml, volgens de instructies van de fabrikant.LET OP: Het gebruik van een Franse pers kan leiden tot ernstige verwondingen. Overschrijd nooit de druklimiet van de gebruikte cel. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Verwijder ongebroken cellen uit het lysaat door centrifugatie bij 4.000 x g gedurende 15 minuten en verzamel het supernatant. Verzamel de membranen door ultracentrifugatie bij 100.000 x g gedurende 1 uur. Resuspendeer de membraanpellet in 10 ml buffer C2 (tabel 2) en meng met een gelijk volume SDS-buffer C3 (tabel 2) met behulp van een kogelgelagerde glashomogenisator.LET OP: β-mercaptoethanol in buffer C3 is giftig. Volg alle relevante veiligheidsvoorschriften. Incubeer de suspensie in een waterbad bij 50 °C gedurende 30 minuten. Centrifugeer het monster gedurende 1 uur bij 100.000 x g bij 20 °C. Resuspensie van de membraankorrel in 10 ml SDS-buffer C4 (tabel 2) met behulp van een kogelgelagerde glashomogenisator en incubeer de suspensie in een waterbad bij 37 °C gedurende 30 minuten.OPMERKING: Als de pellet niet kan worden geresususeerd, voegt u meer SDS-buffer C4 toe tot een volume van 20 ml. Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 100.000 x g bij 20 °C en verzamel het supernatant. Meng het supernatant met octylpolyoxyethyleen (octyl-POE) tot een uiteindelijke wasmiddelconcentratie van 0,5% (g/v) en dialyseer het monster tweemaal tegen buffer C5 (tabel 2) bij 4 °C gedurende 24 uur. Gebruik voor dit doel dialysebuizen met een afsnijding van 20 kDa, volgens de instructies van de fabrikant, en plaats het monster in de dialysebuis of het apparaat.OPMERKING: De afsnijding van de dialysebuizen moet worden aangepast als eiwitten met andere moleculaire massa’s worden gedialyseerd. Beoordeel de zuiverheid van het monster met SDS-PAGE en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een in de handel verkrijgbare eiwittest, volgens het protocol van de fabrikant (materiaaltabel).OPMERKING: Monsters verwarmd tot 95 °C tonen monomeer OmpF. Monsters die niet zijn verwarmd, tonen OmpF in zijn trimerische vorm (figuur 1F). Shock-freeze gedialyseerd OmpF in aliquots in vloeibare stikstof, en bewaren bij -20 °C tot verder gebruik.LET OP: Vloeibare stikstof moet worden behandeld in goed geventileerde ruimtes. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. 2. Optische eenkanaalsopname van ionkanalen in DIB-membranen OPMERKING: In dit gedeelte wordt de procedure beschreven voor het voorbereiden van DIB-membranen in microgefabriceerde polymethylmethacrylaat (PMMA) kamers2 om laterale eiwitbeweging en ionenflux door enkele ionkanalente controleren 17. De afmetingen en exacte tekeningen voor de productie van de kamer zijn te vinden in Lepthin et al.2. Figuur 2 geeft een overzicht van de assemblage van de PMMA-kamer2 en de vorming van de DIB-membranen. Tenzij anders aangegeven, worden alle stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT). Figuur 3 toont een schematische weergave van een DIB-membraan en hoe Ca2+ flux door een enkelkanaalseiwit wordt gebruikt om zowel beweging in het membraan als de open-gesloten toestand van het kanaal te volgen. Bereiding van lipidenVerwijder de in chloroform opgeloste lipide-stockoplossing met 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (25 mg/ml DPhPC) opgelost in chloroform uit de vriezer bij -20 °C en warm tot RT. Voor dit doel is het over het algemeen voldoende om het monster langzaam met de hand gedurende enkele minuten op te warmen.LET OP: Chloroform is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en voer alle procedures met chloroform uit onder een zuurkast. Breng 380 μL DPhPC-stockoplossing (25 mg/ml DPhPC) over in een glazen injectieflacon. Vermijd pipetten met rubberen afdichtingen. Gebruik in plaats daarvan microliter glazen spuiten met roestvrijstalen plunjers. Nadat u de lipidestockoplossing hebt gehanteerd, bedekt u de lipidestockoplossing met Ar- of N2-gas om lipideoxidatie te voorkomen. Gebruik een zo laag mogelijke gasstroom om verdamping van het organische oplosmiddel waarin de lipiden zijn opgelost of spatten van de oplosmiddelsprays uit de injectieflacon te voorkomen. Zorg ervoor dat de deksels van de glazen injectieflacons met lipiden met organisch oplosmiddel aan de binnenkant zijn bedekt met polytetrafluorethyleen (PTFE). Droog het lipidenmonster (stap 2.1.2) onder een stroom van N 2 en verwijder het resterende organische oplosmiddel ‘s nachts onder vacuüm (2,0 mbar) uit het lipidenmonster met behulp van een olievrije vacuümpomp. Los de lipidefilm op in hexadecaan/siliconenolie-oplossing door gelijke volumes hexadecaan en siliconenolie (elk 500 μL) toe te voegen met behulp van een glazen spuit van microliter tot een uiteindelijke lipideconcentratie van 9,5 mg/ml.OPMERKING: De lipidenoplossing is stabiel bij RT gedurende enkele weken. Bereiding van agarose hydrogelBereid ongeveer 1 ml laagsmeltende agarose-oplossing (0,75% [m/v]) in dubbel gedeïoniseerd water en verwarm gedurende 20 minuten tot 85 °C in een verwarmingsblok voor gebruik voor het spinnen van glazen dekplaten.OPMERKING: De agarose-oplossing kan enkele weken bij RT worden bewaard en kan meerdere keren worden opgewarmd. Bereid laagsmeltende agarose-oplossing van 2,5% (m/v) in 0,66 M CaCl 2 en 8,8 mM HEPES (pH7,2 ) en verwarm gedurende 20 minuten tot 85 °C in een verwarmingsblok. Zorg ervoor dat de agarose goed gesmolten is.OPMERKING: De agarose-oplossing kan enkele weken bij RT worden bewaard en kan meerdere keren opnieuw worden opgewarmd, net als de agarose (stap 2.2.1) die wordt gebruikt voor spincoating. Polymethylmethacrylaat (PMMA) kamerassemblage en lipide monolaagvorming op het hydrogel hexadecaan / siliconen olie raakvlakPlaats enkele glazen afdekplaten (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) in een roestvrijstalen afdekplaathouder en reinig ze gedurende 10 minuten in een glazen bekerglas met aceton in een ultrasone reiniger. Gebruik net genoeg aceton om de afdekstroken onder te dompelen en bedek het bekerglas losjes met een glasplaat om een drukloos, gesloten systeem te creëren dat het ontsnappen van dampen tijdens het reinigingsproces minimaliseert.LET OP: Aceton is een licht ontvlambaar oplosmiddel met een laag vlampunt. Damp/luchtmengsels zijn explosief. Bedien de ultrasone reiniger in een goed geventileerde ruimte. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en neem de officiële veiligheidsmaatregelen in acht (bijv. geen open vuur en geen vonken). Spoel de glazen afdekplaten af met dubbel gedeïoniseerd water en droog ze onder een stroom van N2.OPMERKING: Coverslips die op deze manier worden gereinigd, kunnen enkele weken worden bewaard. Reinig en hydrofiliseer een coverslip verder in een plasmareiniger met zuurstof (0,5 mbar) gedurende 5 min.OPMERKING: Voer deze stap uit onmiddellijk vóór het spinnen van de coating met agarose-oplossing, omdat het hydrofiele effect van plasmareiniging na verloop van tijd afneemt. Monteer een met plasma behandelde coverslip op een spincoater (figuur 2, stap 1). Bedek de deklaag met een submicrometer dikke film van agarose door langzaam 140 μL verwarmde 0,75% (w/v) laagsmeltende agarose (stap 2.2.1) toe te voegen bij 3.000 tpm gedurende 30 s, met behulp van een pipet van 200 μL (figuur 2, stap 1).OPMERKING: De dikte van de agarosefilm kan worden bepaald door atoomkrachtmicroscopie (AFM), zoals beschreven17. Bevestig de met spincoating bedekte coverslip met de dunne laag van de agarose hydrogel onmiddellijk aan de onderkant van de PMMA-kamer2. Zorg ervoor dat de agarose hydrogel naar boven wijst (figuur 2, stap 2). Bevestig de randen van de coverslip met transparant plakband aan het PMMA micro-machinaal apparaat. Plaats het PMMA-apparaat op een kookplaat die is verwarmd tot 35 °C (figuur 2, stap 3). Giet voorzichtig 200 μL 2,5% agarose-oplossing (stap 2.2.2) met een pipet in de inlaat van de kamer (figuur 2, stap 3), zonder luchtbellen te creëren, zodat de dunne hydrogel die door spincoating wordt aangebracht, in evenwicht kan komen met de buffer van de 2,5% agarose-oplossing en gehydrateerd blijft. Zorg ervoor dat de 2,5% agarose-oplossing rond de met spincoating bedekte agarosehydrogel wordt verspreid, maar er niet overheen (figuur 3A), wat kan worden vermeden door de PMMA-kamer voorzichtig op de verwarmingsplaat te drukken. Bedek de putjes van de PMMA-kamer (figuur 2, stap 4) onmiddellijk met in totaal 60 μl lipide/olieoplossing (stap 2.1.5), om de vorming van lipidemonolagen op het agarose-olie-grensvlak te initiëren en uitdroging van de met spin bedekte agarose in de putjes van de PMMA-kamer te voorkomen. Houd het apparaat ongeveer 2 uur op een hete plaat bij 35 °C.OPMERKING: De cirkelvormige putten in de PMMA-kamer hebben een diameter van 0,5 mm en een diepte van 1,8 mm, volgens eerder gepubliceerd werk2. Bereiding van met lipiden gecoate waterige druppeltjes in hexadecaan/siliconenolie-oplossingBreng 20 μl lipidehexadecaan/siliconenolieoplossing (stap 2.1.5) aan op elk van de verschillende microgefabriceerde putjes in een druppelincubatiekamer (figuur 2, stap 4). Geschikte containers voor de lipide hexadecaan / siliconenolie-oplossing zijn kleine uitsparingen van 40 mm x 30 mm x 3,5 mm in een dunne PMMA-plaat2. Bereid een microcapillaire glazen naald met een tipopeningsdiameter van 20 μm met behulp van een verticale of horizontale micropipettrekker (bijvoorbeeld gebruikt voor het maken van patchpipetten of scherpe glaselektroden). Schat de openingsdiameter van de microcapillaire glazen naald onder een binoculaire stereomicroscoop bij lage vergroting, in een zoombereik tussen 7,5x en 35x.OPMERKING: De instellingen voor de voorverwarmingsmodus voordat aan het glazen capillair wordt getrokken, de verwarmingsmodus voor het trekken en de trekkracht moeten van tevoren experimenteel worden bepaald, volgens de specificaties van de fabrikant van het trekapparaat en het type capillair. Vul de microcapillaire glazen naald met 5 μL waterige injectieoplossing met 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl en 30 nM TOM-kerncomplex, of als alternatief 20 nM OmpF met behulp van een microcapillaire pipetpunt. Gebruik alleen dubbel gedestilleerd water dat eerder is behandeld met een chelaathars die multivalente metaalionen (Ca2+) bindt om de waterige injectieoplossing te bereiden. Monteer de microcapillaire glazen naald met de waterige injectie-oplossing op een piëzo-aangedreven nanoinjector. Injecteer 100-200 nL waterige druppels (figuur 2, stap 4) met 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl en 30 nM TOM-kerncomplex (stap 1.1.12), of als alternatief 20 nM OmpF (stap 1.2.16) in de putjes in de druppelincubatiekamer gevuld met lipide hexadecaan/siliconenolie-oplossing (zie 2.1.5) met behulp van de nanoinjector. Zorg ervoor dat de druppels elkaar niet raken door ze enkele millimeters (>10 mm) uit elkaar in de putjes te plaatsen. Anders, als lipide monolagen zich nog niet hebben gevormd op het olie/ buffer grensvlak, zullen ze samensmelten tot grotere druppels.OPMERKING: Als er geen klassecapillairen en nano-injectoren beschikbaar zijn, kunnen de druppels ook handmatig worden bereid met eenkanaals microliterpipetten voor volumes tussen 0,1 μl en 0,5 μl, zoals beschreven2. In dit geval zijn de druppelvolumes echter niet zo nauwkeurig. Laat de vorming van een lipide monolaag op het druppel/olie-grensvlak gedurende ongeveer 2 uur toe door de PMMA- en druppelincubatiekamers (figuur 2, stap 4) op een tot 35 °C verwarmde hete plaat te houden. Voorbereiding en beeldvorming van enkele ionkanalen in DIB-membranenBreng handmatig individuele waterige druppels uit de putjes van de druppelincubatiekamer onder een stereomicroscoop over in de putjes van de PMMA-kamer (figuur 2, stap 5), met behulp van een eenkanaals microliterpipet met een polypropyleenpunt van 10 μL voor eenmalig gebruik. Laat de druppels gedurende ongeveer 5 minuten op de lipide monolagen gevormd op de hydrogel-olie interfaces zinken om een lipide bilaag (figuur 3) te vormen tussen de druppels en de agarose hydrogel. Monteer de PMMA-kamer met DIB-membranen op de monsterhouder van een microscoop met omgekeerd licht en beoordeel de membraanvorming met behulp van een 10x Hoffman modulatiecontrastobjectief (figuur 2, stap 6). DIB-membraanvorming wordt aangegeven door een heldere witte ring op het grensvlak tussen de druppel en de hydrogel (figuur 4A). DIB-membranen die zijn gebroken, tonen deze ring niet (figuur 4B).OPMERKING: Als alternatief kunnen de DIB-membranen worden gevisualiseerd bij 10x vergroting door fasecontrast of differentieel interferentiecontrast (DIC) microscopie. Als DIB-membranen zijn gevormd, monteer dan de PMMA-kamer op de monsterhouder van een TIRF-microscoop (figuur 2, stap 7) uitgerust met een conventionele lichtbron voor epifluorescentieverlichting, een 488 nm-laser (Pmax = 100 mW) en een verlichte elektronenvermenigvuldigende CCD-camera (512 x 512 pixels; >95% QE) om een pixelgrootte van ~ 0,16 μm te bereiken. Focus de rand van een DIB-membraan met een 10x vergrotingsobjectief onder epifluorescentieverlichting met een lichtbron met hoge intensiteit met behulp van een GFP-filterset. Fijnfocus op dezelfde rand van het DIB-membraan bij hoge vergroting met een 100x/N.A. 1.49 apochromaatolie TIRF-objectief, opnieuw onder epifluorescentieverlichting, met de lichtbron met hoge intensiteit met behulp van een GFP-filterset waarmee zwakke achtergrondfluorescentie van de fluorescerende kleurstof Fluo-8 in de druppel kan worden gevisualiseerd (figuur 4C). Wijzig de filterinstelling van GFP in de quad-band TIRF-filterset. Schakel de 488 nm laser in en stel de intensiteit van de laser op de objectieflens in op een waarde tussen 8 mW en 10 mW.OPMERKING: Aangezien er vaak geen kwantitatieve informatie is over de laserintensiteit bij de objectieflens, moeten de laserintensiteitsinstellingen vooraf worden gekalibreerd in afzonderlijke metingen aan de lens, met een optische laservermogensmeter uitgerust met een fotodiodesensor, volgens de specificaties van de fabrikant.LET OP: Om een veilige werking van de laser te garanderen, moet de operator zich bewust zijn van de mogelijke gevaren van laserstraling en de voorschriften voor ongevallenpreventie. Om afzonderlijke ionkanalen te visualiseren, past u de TIRF-hoek en EMCCD-cameraversterking aan (bijv. EM-versterkingsmultiplicatorinstelling: 285) zodat open ionkanalen in het DIB-membraan verschijnen als fluorescerende vlekken met hoog contrast op een donkere achtergrond (figuur 4D-G) en de signaal-achtergrondverhouding, wanneer visueel geïnspecteerd, een maximum bereikt. Zorg ervoor dat de vlekken, overeenkomend met Ca2+-flux door enkele ionkanalen, scherp blijven en een ronde vorm hebben, met een hoge intensiteit in het midden en geleidelijk afnemend naar de periferie. Membranen zonder kanalen vertonen alleen achtergrondfluorescentie (figuur 4C). Voordat u de beweging en open-gesloten activiteit van afzonderlijke kanalen in de loop van de tijd registreert, controleert u of fluorescerende vlekken scherp zijn, om ervoor te zorgen dat de ionkanalen zich in de DIB-membranen hebben gereconstitueerd en lateraal in het membraanvlak bewegen. Als dit niet het geval is, kan dit erop wijzen dat een fluorescerend molecuul in en uit het evanescente veld duikt dat door de laser in de buurt van het membraan wordt gegenereerd. Neem een reeks membraanbeelden op die een goede tracking van de positie en monitoring van de open-gesloten toestand van de afzonderlijke ionkanalen mogelijk maken. Om het type laterale mobiliteit (bijv. vrije beweging versus voorbijgaande verankering [ter referentie, zie16]) en de toestand van kanaalactiviteit (bijv. open of gesloten) te bepalen, verwerven voldoende lange (bijv. 30 s tot 1 min) en goed bemonsterde trajecten (bijv. framesnelheid van 48 s-1).OPMERKING: De waarneming van gekanaliseerde, beperkte of hopdiffusie16 vereist dat de bemonsteringssnelheid voldoende snel is om onbeperkte diffusie binnen beperkende grenzen te meten. Zorg er bovendien voor dat de bemonsteringstijd van de gegevens lang genoeg is om de overgang van ongelimiteerde naar beperkte diffusie te meten (zie Jacobson et al.16 voor details). Beeld- en gegevensverwerkingOPMERKING: Open-source beeldverwerkingspakketten33 of zelfgeschreven routines17 op basis van commerciële softwarepakketten kunnen worden gebruikt om de spatiotemporele dynamiek van individuele ionkanalen in DIBs te analyseren. Om laterale membraanmobiliteit te kunnen correleren met de ionenflux door de afzonderlijke kanalen, mogen geen filteralgoritmen worden toegepast.Corrigeer beeldtijdreeksen voor bleken door standaardprocedures34 toe te passen met behulp van zelfgeschreven routines, door de gemiddelde frame-intensiteit van het volledige beeld aan te passen aan , waarbij t de frame-index (tijd) is en akde aanpassingsparameters. Corrigeer vervolgens de tijdreeks volgens , waarbij I(t) de intensiteit is. Als alternatief kunt u voor initiële gegevensanalyses achtergrondcorrecties uitvoeren met behulp van open source-software met geïmplementeerde rollende balalgoritmen33 en een rollende balradius, afhankelijk van de spot en pixelgrootte van de camera (bijvoorbeeld 50 pixels). Bepaal de ruimtelijke posities en amplitudes van een fluorescentiespot binnen een gedefinieerd gebied van belang (ROI) (bijvoorbeeld 30 x 30 pixels), door I(t) op een bepaald moment t aan te passen aan een tweedimensionale Gaussische functie met vlakke kanteling die rekening houdt met mogelijke lokale verlichtingsgradiënten volgens . Hier is x = (x, y) de ROI met de fluorescentie-intensiteitsinformatie, A en σ zijn de amplitude en breedtes van de Gauss, pk zijn parameters die de achtergrondintensiteit van de ROI karakteriseren en μ = (x 0, y 0) definieert de positie van de Gauss. De ionenflux door een individueel kanaal wordt gegeven door de parameter A. De baan van het kanaal wordt gegeven door x en maakt het mogelijk om de laterale mobiliteit van het kanaal te bepalen. Als alternatief is het mogelijk om de posities en intensiteiten van individuele spots te bepalen met behulp van open-source platforms33 en plug-ins zoals beschreven35,36. Schat de positionele nauwkeurigheid37 na conversie van de EMCCD-camera-uitlezing in fotonennummers38. Plot de fluorescentieamplitude A versus tijd en het bijbehorende traject x om een mogelijke correlatie tussen de kanaaldiffusiviteit en de ionenflux door het kanaal te bepalen. Voer dit uit met elke grafische software. Bepaal in geval van vrije laterale kanaalbeweging de laterale diffusiecoëfficiënt D door lineaire regressie van de tijdvertraging τ en bereken de gemiddelde kwadratische verplaatsing van de vlekken van x volgens .OPMERKING: Typische diffusiecoëfficiënten17 voor TOM-CC en OmpF die vrij bewegen in DIB-membranen variëren tussen 0,5 en 1,5 μm2 s-1. Moleculen waarvan de diffusieconstante kleiner is dan 0,01 mm2·s-1 worden gedefinieerd als geïmmobiliseerd17.