使用全内反射荧光（TIRF）显微镜对脂质双层中的横向迁移率和离子通道活性进行单分子成像

1. 蛋白质生产 注意：本节描述了从缺乏LamB和OmpC的大肠杆菌中分离OmpF的程序，以及从神经孢子虫中分离OmpF的过程（图1）28，29。后者需要从含有 6xHis 标记形式的 TOM 亚基 Tom22 的 N. crassa 菌株 28 中分离线粒体（图 1A），可以如描述28 所述进行分离。以下方案通常产生 1-2 毫克克拉萨猪笼草 TOM-CC 和 10 毫克大肠杆菌 OmpF。如果要调整量，必须精确保持蛋白质/洗涤剂的比例。除非另有说明，否则所有步骤应在4°C下进行。 TOM核心复合物的分离根据Bausewein等人30的说法，在20mM Tris-HCl（pH 8.5），1%（w / v）DDM，20%（v / v）甘油，300mM NaCl，20mM咪唑和1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）中以10mg / mL的蛋白质浓度溶解通过从约1.5kg（湿重）菌丝中差异沉降获得的纯化N. crassa线粒体（2g蛋白质）在4°C下30分钟。注意：PMSF有毒。穿戴适当的个人防护装备。 将溶解的线粒体转移到超速离心管中，并通过在4°C下以130，000× g 超速离心40分钟并用标准级滤纸过滤，将未溶解的膜与溶解的膜蛋白分离。 使用自动蛋白质纯化系统将预包装的Ni-NTA色谱柱（体积为5 mL）与约5柱体积（CV）的缓冲液A1（表1）平衡。在所有步骤中以1 mL/min的恒定流速运行Ni-NTA色谱柱。如果从少于 2 g 的线粒体中分离出蛋白质，请使用体积较低的色谱柱 （1 mL）。 将溶解的蛋白质样品以1 mL/min的流速加载到Ni-NTA色谱柱上。 用5 CV的缓冲液A1洗涤Ni-NTA柱（表1）以去除未结合的蛋白质。 用30%缓冲液A2洗脱His标记的TOM-CC（表1;300 mM咪唑），并收集280 nm色谱图中出现的蛋白质峰（图1B）。 为了进一步纯化TOM-CC，使用自动蛋白质纯化系统将预填充的阴离子交换柱（1 mL）与缓冲液B1、B2和B1各5 CV（表1）平衡。在所有步骤中以 1 mL/min 的恒定流速运行阴离子交换柱。 将TOM-CC峰级分（步骤1.1.6）加载到阴离子交换柱上（流速为1 mL/min）。 通过用5 CV缓冲液B1（表1）和0%-20%缓冲液B2的线性盐梯度洗涤色谱柱（表1）来除去未结合的蛋白质。 用20%-35%缓冲液B2的线性盐梯度洗脱TOM-CC，并收集280 nm色谱图中出现的蛋白质峰级分（图1C）。 根据制造商的方案，通过SDS-PAGE（图1D）评估样品纯度，并使用市售蛋白质测定法确定蛋白质浓度（参见 材料表）。 将蛋白质样品冷冻在液氮中，并将其储存在-80°C直至进一步使用。注意：液氮应在通风良好的地方处理。穿戴适当的个人防护装备。   OmpF 的分离在无菌条件下从冷冻甘油原液中回收缺乏LamB和OmpC32的大肠杆菌菌株BE BL21（DE3）omp6，并划线到Luria-Bertani（LB）琼脂平板上（表2）。为此，逐渐将样品均匀地铺在整个板上。 让样品浸泡在琼脂中5分钟，然后倒置板盖上盖子并在37°C孵育过夜。 选择一个 单一的大肠杆菌 菌落，使用无菌牙签用该菌落接种7.5mL LB培养基（表2），并在37°C下搅拌（170rpm）生长过夜（14小时）。 用无菌移液器将2 x 1 mL 大肠杆菌 细胞转移到2 x 500 mL的LB培养基中（表2），并在摇床中搅拌（~170rpm）在37°C下生长过夜（~14小时）。 通过在4°C下以5，000× g 离心20分钟收获细胞，将沉淀冷冻在液氮中，并储存在-80°C直至进一步使用。注意：细胞沉淀的湿重通常为每1升培养物5g。此时，协议可以暂停。 解冻细胞（2 g）并将其重悬于20 mL裂解缓冲液C1（表2）中，并根据制造商的说明，在1，000 psi下将悬浮液通过预冷（4°C）高压细胞破碎系统三次，最大样品体积为35 mL。注意：使用法国压力机可能会导致严重伤害。切勿超过所用电池的压力限制。穿戴适当的个人防护装备。 通过以4，000× g 离心15分钟从裂解物中除去未破碎的细胞，并收集上清液。 通过以100，000× g 超速离心1小时来收集膜。 将膜沉淀重悬于10 mL缓冲液C2中（表2），并使用滚珠玻璃均质器与等体积的SDS缓冲液C3（表2）混合。注意：缓冲液C3中的β-巯基乙醇是有毒的。遵守所有相关安全法规。 将悬浮液在50°C的水浴中孵育30分钟。 将样品在20°C下以100，000× g 离心1小时。 使用滚珠玻璃均质器将膜沉淀重悬于10mL SDS缓冲液C4（表2）中，并将悬浮液在37°C的水浴中孵育30分钟。注意：如果沉淀无法重悬，请添加更多SDS缓冲液C4，直至体积为20 mL。 将样品在20°C下以100，000× g 离心30分钟，并收集上清液。 将上清液与辛基聚氧乙烯（辛基POE）混合至最终洗涤剂浓度为0.5%（w / v），并将样品在4°C下与缓冲液C5（表2）透析两次24小时。为此，根据制造商的说明，使用切断为20 kDa的透析管，并将样品放入透析管或设备中。注意：如果透析具有其他分子量的蛋白质，则需要调整透析管的切断。 根据制造商的方案（材料表），通过SDS-PAGE评估样品纯度，并使用市售蛋白质测定法确定蛋白质浓度。注意：加热至95°C的样品显示单体OmpF。未加热的样品显示三聚体形式的OmpF（图1F）。 在液氮中等分试样的电冻透析OmpF，并储存在-20°C直至进一步使用。注意：液氮应在通风良好的地方处理。穿戴适当的个人防护装备。 2. DIB膜中离子通道的光学单通道记录 注意：本节描述了在微加工聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）室2 中制备DIB膜的程序，以监测通过单离子通道17的横向蛋白质运动和离子通量。制造腔室的尺寸和确切图纸可以在Lepthin等人2中找到。 图 2概述了PMMA室2 的组装和DIB膜的形成。除非另有说明，否则所有步骤均在室温（RT）下进行。 图3 显示了DIB膜的示意图，以及如何使用通过单通道蛋白的Ca2+ 通量来监测膜中的运动和通道的开闭状态。 脂质的制备从-20°C的冰箱中取出含有1，2-二植酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（25mg / mL DPhPC）的脂质储备溶液，并加热至室温。为此，通常用手缓慢加热样品几分钟就足够了。注意：氯仿有毒。穿戴适当的个人防护设备，并在通风橱下执行所有涉及氯仿的程序。 将 380 μL DPhPC 储备溶液（25 mg/mL DPhPC）转移到玻璃小瓶中。避免使用带有橡胶密封件的移液器。相反，请使用带有不锈钢柱塞的微升玻璃注射器。 处理完脂质储备溶液后，用Ar或N2 气体覆盖脂质储备溶液以防止脂质氧化。使用尽可能低的气流，以避免溶解脂质的有机溶剂蒸发或溶剂从小瓶中喷出。确保含有有机溶剂脂质的玻璃小瓶的盖子内部涂有聚四氟乙烯（PTFE）。 在N 2的流下干燥脂质样品（步骤2.1.2），并使用无油真空泵在真空（2.0毫巴）下从脂质样品中除去剩余的有机溶剂过夜。 使用微升玻璃注射器加入等体积的十六烷和硅油（各 500 μL），将脂质膜溶解在十六烷/硅油溶液中，最终脂质浓度为 9.5 mg/mL。注意：脂质溶液在室温下稳定数周。 琼脂糖水凝胶的制备在双去离子水中制备约1mL低熔点琼脂糖溶液（0.75%[w / v]），并在加热块中加热至85°C20分钟，用于旋涂玻璃盖玻片。注意：琼脂糖溶液可以在室温下保存数周，并且可以重新加热几次。 在0.66M CaCl 2和8.8mM HEPES（pH 7.2）中制备低熔点2.5 %（w / v）琼脂糖溶液，并在加热块中加热至85°C20分钟。确保琼脂糖融化良好。注意：琼脂糖溶液可以在室温下保存数周，并且可以重新加热几次，就像用于旋涂的琼脂糖（步骤2.2.1）一样。 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室组装和水凝胶十六烷/硅油界面处脂质单层的形成将一些玻璃盖玻片（40 mm x 24 mm x 0.13 mm）放入不锈钢盖玻片支架中，并在玻璃烧杯中用超声波清洁器中的丙酮清洁10分钟。使用恰到好处的丙酮浸没盖玻片，并用玻璃板松散地覆盖烧杯，以创建一个无压力的封闭系统，最大限度地减少清洁过程中蒸汽的逸出。注意：丙酮是一种高度易燃的溶剂，闪点低。蒸汽/空气混合物具有爆炸性。在通风良好的区域操作超声波清洗机。穿戴适当的个人防护设备并遵守官方安全预防措施（例如，没有明火和火花）。 用双去离子水冲洗玻璃盖玻片，并在N2的流下干燥。注意：以这种方式清洁的盖玻片可以存放数周。 在等离子清洁器中用氧气（0.5毫巴）进一步清洁和亲水化盖玻片5分钟。注意：在用琼脂糖溶液旋涂之前立即执行此步骤，因为等离子清洗的亲水效果会随着时间的推移而消失。 将等离子处理的盖玻片安装在旋涂机上（图2，步骤1）。 使用 200 μL 移液器，以 3，000 rpm 缓慢加入 140 μL 加热的 0.75% （w/v） 低熔点琼脂糖（步骤 2.2.1），持续 30 秒，用亚微米厚的琼脂糖膜涂覆盖玻片（图 2，步骤 1）。注意：琼脂糖膜的厚度可以通过原子力显微镜（AFM）确定，如17所述。 立即将带有琼脂糖水凝胶薄层的旋涂盖玻片连接到PMMA室2的下侧。确保琼脂糖水凝胶指向上方（图2，步骤2）。 用透明胶带将盖玻片的边缘固定在PMMA微加工设备上。 将PMMA设备放在加热至35°C的热板上（图2，步骤3）。 用移液管小心地将200μL的2.5%琼脂糖溶液（步骤2.2.2）倒入腔室的入口中（图2，步骤3），不要产生气泡，以便通过旋涂施加的薄水凝胶可以与2.5%琼脂糖溶液的缓冲液平衡并保持水分。确保2.5%琼脂糖溶液散布在旋涂琼脂糖水凝胶周围，而不是在其上（图3A），这可以通过将PMMA室轻轻压在加热板上来避免。 立即用总共60μL脂质/油溶液（步骤2.1.5）覆盖PMMA室的孔（图2，步骤4），以在琼脂糖 – 油界面处启动脂质单层形成，并避免PMMA室孔中的旋涂琼脂糖脱水。将设备保持在35°C的热板上约2小时。注意：根据先前发表的工作2，PMMA室中的圆形孔直径为0.5毫米，深度为1.8毫米。 在十六烷/硅油溶液中制备脂质包被的水滴将 20 μL 脂质十六烷/硅油溶液（步骤 2.1.5）放入液滴孵育室中的几个微制孔中（图 2，步骤 4）。脂质十六烷/硅油溶液的合适容器是薄PMMA板2中的40 mm x 30 mm x 3.5 mm小凹槽。 使用垂直或水平微量移液器拉拔器（例如，用于制作贴片移液器或锋利的玻璃电极）制备尖端开口直径为 20 μm 的微毛细管玻璃针。在低放大倍率的双目体视显微镜下估计微毛细管玻璃针的开口直径，变焦范围在 7.5 倍到 35 倍之间。注意：拉动玻璃毛细管前的预热模式、拉动的加热模式和牵引力的设置应根据制造商对拉动装置的规格和毛细管的类型提前实验确定。 用含有 8.8 mM HEPES （pH 7.2）、7 μM Fluo-8、400 μM EDTA、1.32 M KCl 和 30 nM TOM 核心复合物的水溶液填充微毛细管玻璃针头，或使用微毛细管移液管吸头填充 20 nM OmpF。仅使用先前用结合多价金属离子（Ca2+）的螯合树脂处理的双蒸水来制备水性注射溶液。 将微毛细管玻璃针与水性注射溶液安装在压电驱动的纳米注射器上。 将含有8.8mM HEPES（pH 7.2），7μM Fluo-8，400μM EDTA，1.32M KCl和30nM TOM核心复合物（步骤1.1.12）的100-200nL水滴（图2，步骤4）注入使用纳米注射器填充有脂质十六烷/硅油溶液（参见2.1.5）的液滴孵育室中的孔中。通过将液滴相距几毫米（>10 毫米）放入孔中，确保液滴不会相互接触。否则，如果在油/缓冲界面尚未形成脂质单层，它们将合并成更大的液滴。注意：如果没有可用的毛细管和纳米进样器，也可以使用单通道微升移液器手动制备液滴，体积在0.1μL至0.5μL之间，如2所述。然而，在这种情况下，液滴体积并不那么准确。 通过将PMMA和液滴孵育室（图2，步骤4）保持在加热至35°C的热板上，允许在液滴/油界面形成脂质单层约2小时。 DIB膜中单离子通道的制备和成像使用带有10μL一次性聚丙烯吸头的单通道微升移液管，在体视显微镜下将液滴孵育室的孔中的单个水滴手动转移到PMMA室的孔中（图2，步骤5）。让液滴沉入在水凝胶 – 油界面形成的脂质单层上约5分钟，以在液滴和琼脂糖水凝胶之间形成脂质双层（图3）。 将带有DIB膜的PMMA室安装在倒置光学显微镜的样品架上，并使用10倍霍夫曼调制对比物镜评估膜形成（图2，步骤6）。DIB膜的形成由液滴和水凝胶之间界面处的透明白环表示（图4A）。已破裂的DIB膜不显示该环（图4B）。注意：或者，DIB膜可以通过相衬或微分干涉对比（DIC）显微镜在10倍放大倍率下可视化。 如果已形成DIB膜，则将PMMA室安装在TIRF显微镜的样品架上（图2，步骤7），该显微镜配备用于落射荧光照明的传统光源，488 nm激光器（Pmax = 100 mW）和背照式电子倍增CCD相机（512 x 512像素;>95% QE）以实现~0.16μm的像素尺寸。 使用GFP滤光片组，在落射荧光照明下，使用高强度光源，用10倍放大镜聚焦DIB膜的边缘。 再次在落射荧光照明下，使用100x/N.A. 1.49复消色差油TIRF物镜在高放大倍率下精细聚焦DIB膜的同一边缘，使用GFP滤光片组的高强度光源，允许可视化液滴中荧光染料Fluo-8的弱背景荧光（图4C）。 将滤波器设置从 GFP 更改为四频 TIRF 滤波器组。 打开488 nm激光器，并将物镜上的激光强度设置为8 mW至10 mW之间的值。注意：由于物镜上通常没有关于激光强度的定量信息，因此应根据制造商的规格，使用配备光电二极管传感器的光学激光功率计，在镜头的单独测量中事先校准激光强度设置。注意：为确保激光器的安全操作，操作员必须了解激光辐射的可能危险和事故预防规定。 要可视化单个离子通道，请调整TIRF角度和EMCCD相机增益（例如，EM增益倍增器设置：285），以使DIB膜中的开放离子通道在深色背景上显示为高对比度荧光斑点（图4D-G），并且在目视检查时，信噪比达到最大值。确保通过单个离子通道的与Ca2+通量相对应的斑点保持聚焦并具有圆形，中心强度高，向外围逐渐减小。没有通道的膜仅显示背景荧光（图4C）。 在记录各个通道随时间推移的移动和开闭活性之前，请检查荧光点是否聚焦，以确保离子通道已重组到DIB膜中并在膜平面中横向移动。如果不是这种情况，它可能表明荧光分子正在浸入和退出由膜附近激光产生的倏逝场。 记录一系列膜图像，以便正确跟踪位置并监测各个离子通道的开闭状态。为了确定横向移动性的类型（例如，自由运动与瞬态锚定[作为参考，见16]）和通道活动的状态（例如，打开或关闭），获取足够长的轨迹（例如，30秒到1分钟）和采样良好的轨迹（例如，48 s-1的帧速率）。注意：观察通道、限制或跳跃扩散16 要求采样速率足够快，以测量限制边界内的无限制扩散。此外，确保数据采样时间足够长，以测量从无约束扩散到约束扩散的过渡（有关详细信息，请参阅Jacobson等人16）。 图像和数据处理注意：基于商业软件包的开源图像处理包33 或自写例程17 可用于分析DIB中单个离子通道的时空动力学。为了能够将侧向膜迁移率与通过各个通道的离子通量相关联，不应应用滤波算法。通过使用自写例程应用标准过程34，通过将完整图像的平均帧强度拟合到 ，其中 t 是帧索引（时间），k 是拟合参数，从而纠正漂白的图像时间序列。然后，根据 更正时间序列，其中 I（t） 是强度。或者，对于初始数据分析，根据相机的光斑和像素大小（例如，50像素），使用具有实现滚球算法33和滚球半径的开源软件执行背景校正。 通过将给定时间t的I（t）拟合到具有平面倾斜的二维高斯函数，确定定义感兴趣区域（ROI）（例如，30 x 30像素）内荧光点的空间位置和振幅，该函数根据.这里，x = （x， y） 是带有荧光强度信息的 ROI，A 和 σ 是高斯的振幅和宽度，pk 是表征 ROI 背景强度的参数，μ = （x 0， y 0） 定义高斯的位置。通过单个通道的离子通量由参数A给出。通道的轨迹由 x 给出，并允许确定通道的横向移动性。或者，可以使用开源平台33和插件35，36来确定各个斑点的位置和强度。估计将EMCCD相机读出转换为光子数38后的位置精度37。 绘制荧光幅度A随时间的变化以及相应的轨迹x，以确定通道扩散系数与通过通道的离子通量之间的可能相关性。使用任何图形软件执行此操作。在自由横向通道运动的情况下，通过时滞τ的线性回归确定横向扩散系数D，并根据x 计算光斑的均方位移。注意：TOM-CC 和 OmpF 在 DIB 膜中自由移动的典型扩散系数17 范围在 0.5 和 1.5 μm2 s-1 之间。扩散常数小于0.01 mm2·s-1 的分子定义为固定化17。